שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה
Summary
עיתוי החשיפה לליפות עלול להשפיע על תוצאותיה ההתפתחותיות. כאן אנו מראים כיצד לשחרר את התמונה של חלבון מורפולאחר העצם של דרוזוהילה (BMP) שנקרא dpp מתאים של הדיסק כנף.
Abstract
שינוי מקדם הצמיחה-בטא (TGF-β) סופר משפחה חיונית עבור המבנה העובריים המוקדמים ופיתוח של מבנים מבוגרים באורגניזמים רב-תאיים. TGF-β סופר משפחה כולל TGF-β, עצם חלבון מורורגנטי (BMPs), הפעלות, צמיחה ובידול, ו Nodals. זה כבר מזמן ידוע כי כמות ליגו חשוף לתאים חשוב השפעותיו. זה היה חשוב כי מעברי הריכוז לטווח ארוך להגדיר דפוס עובריים. עם זאת, לאחרונה התברר כי עיתוי החשיפה לליפות אלה חשוב גם עבור ההשלכות שלהם במורד הזרם. Tgf-β סופרמשפחה ליגנד לא יכול להיות תוצאה התפתחותית עד שהוא שוחרר מתא שבו הוא הופק. עד לאחרונה, היה קשה לקבוע מתי הליטרים האלה שוחררו מתאים. כאן אנו מראים כיצד למדוד את שחרורו של Drosophila ילה BMP הנקרא עריפת ראש (dpp) מן התאים של הראש הזרוע הפרידיום או הכנף. ניתן לשנות שיטה זו עבור מערכות אחרות או לאותת ליגנדס.
Introduction
עצם מורורגנטית חלבונים (BMPs) הם חיוניים עבור embryogenesis מוקדם והסדר של מבנים מבוגרים. BMPs מיוצרים ומופרש כדי להשפיע על תמלול של גנים היעד הדרושים הגידול התא בידול בתאים מגיבים. עריפת ראש (Dpp) היא מטוס הומוסוזוזה של BMP4 שחשוב לפיתוח מבנים עובריים ומבוגרים כמו כנף1,2,3,4. כמה קבוצות התמקדו בתפקיד של Dpp כנפיים לעוף מבוגרים בגלל 1) כנפיים מורכב משני גיליונות epithelia שקוף עם דפוס עקביות עקבית שניתן להעריך בקלות; 2) הדיסקים הכנף הם גם שטוחים באופן סביר, יכול להיות מתורבת מחוץ לזחל, והם פשוטים התמונה והבדלים לכמת בתבנית; ו 3) הפיתוח דפוס הכנף רגיש Dpp כגון רטבאליות קטן בשביל יהיה להשפיע הכנף והוא.
Dpp מופק בתאים הממוקמים בגבול הקדמי/אחורי של דיסק כנף5,6,7,8. Dpp נקשר לקומפלקס מסוג 1 ו-2 קולטני סרין/טראונין קינאז9,10. עם כריכת Dpp, הסוג 2 קולטן זרחתיים את סוג 1 הקולטן אשר לאחר מכן זרחני אמהות נגד Dpp (משוגע), Smad 1/5/8 הומויומן. מגייסים מגויסים שכונתיות נוספת (מדיאה), אשר מאפשר לו להיכנס לגרעין שבו הוא מווסת את הגנים היעד, המוביל לתופעות למטה כגוןהתפשטות אובידול 4,11.
לאחרונה, מעבדת בייטס הראתה כי שחרורו הבלתי ראוי של dpp בתוך הדיסק הכנף יכול להוביל לירידה בזירחון מטורף, הפחתה בביטוי הגנים היעד, ופגמים כנף12,13. מספר ערוצי יונים משפיעים על התפתחות אגף דרוזוהילה ומבנים משויכים14,15. ערוצי יונים אלה יכולים גם להיות מעורבים במהדורת Dpp. בקביעת המנגנון של שחרור מורפוגן, חשוב כי יש שיטה להמחיש את האירועים שחרור.
ד”ר אאורליו טלמאן וסטיבן כהן יצרו חלבון היתוך Dpp-GFP אשר מסוגל להציל אובדן של Dpp, כלומר הוא פעיל ביולוגית ושוחרר באופן ביולוגית רלוונטי16. כאן, אנו מתארים כיצד אנו מדמיינים Dpp לשחרר אירועים באמצעות זה Dpp-GFP. חלבון זה היתוך שימושי במיוחד כי GFP הוא pH רגיש כך כאשר הוא בתוך שלפוחיות חומציים, הזריחה היא17. לכן, כאשר חלבון מתויג עם GFP הוא שוחרר שלפוחית לתוך הסביבה מגלותי יותר נייטרלי, עוצמת הזריחה GFP מגדילה17. ניצלנו את הרגישות של ה-pH של GFP כדי לקבוע אם Dpp-GFP נמצא בתוך שלפוחיות חומציים. אנו התמונה דיסקים כנף המבטא Dpp-GFP לפני ואחרי תוספת של אמוניום כלוריד, אשר מנטרל תאים תאיים ושלפוחיות18. מצאנו עלייה משמעותית בקרינה הפלואורסצנטית לאחר תוספת של אמוניום כלוריד, הרומז כי Dpp-GFP מצוי לפני התוספת של אמוניום כלוריד18. אנו מסיקים כי Dpp-GFP התאיים שוכן בתאי קרום חומצי מאוגד, כגון ושלפוחיות, והוא משוקם בתוספת של אמוניום כלוריד לנטרל את ה-pH של תאי תאיים18. זה עושה הדמיה חיה של Dpp-GFP טכניקה שימושית כדי להמחיש את הדינמיקה של Dpp בדיסק כנף Drosophila ילה כפי שהוא שוחרר מתאי חומצי לתוך הסביבה מגלומת.
כאן, אנו מתארים את השיטה אנו משתמשים כדי להמחיש את Dpp לשחרר אירועים באמצעות Dpp-GFP. Dpp-GFP ניתן להתבטא בתבנית מקורית שלה בתוך מערכת הדיסקים של Drosophila ילה באמצעות המערכת UAS-GAL419. זוהי השיטה ששימש כדי לקבוע כי ערוצי Irk השפעה שחרור Dpp18. הצלחנו לאמת את השיטה. ע י הדמיה חיה בערימות אנחנו לא רואים Dpp-GFP לנוע בתוך מישור המיקוד בסדרת הזמן אם רכשנו במישור אחד של מיקוד. אנחנו גם לא רואים תנועה של Dpp-GFP דקדטתא אם אנו מתמונה במחסנית z. אנו מסיקים כי ה-Dpp-GFP שנראה באמצעות שיטה זו הם שחרור אירועים ולא תנועה של שלפוחיות intracellularly. שיטה זו של לחיות הדמיה של Dpp-GFP יכול לשמש כדי לבדוק מודיטים אחרים של המהדורה Dpp עבור השפעתם על הדינמיקה Dpp או יכול להיות שונה כדי להסתכל על הדינמיקה של ליגונים אחרים
Protocol
Representative Results
Discussion
BMPs כגון Dpp להפוך את ההשפעה המשמעותית שלהם כאשר הם לאגד מורכבות של קולטנים מאוגדים קרום כדי לגרום מפל של איתות תאיים בתאים השכנה או מרחוק כנראה. מעבדתו של ד ר תומס קורנברג הראו כי תאים המייצרים את אות dpp בתאי מגע המקבלים את האות באמצעות אקטין מבוסס filapodia דק מבנים כמו המכונה cytonemes15…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוני להודות לד ר סאראלה פראדהן על עבודה על גרסה מוקדמת יותר של פרוטוקול זה. אנחנו רוצים להודות NSF-IOS 1354282 למימון בזמן שפיתחנו את הפרוטוקול. היינו רוצים להודות NIH-נדבך RO1DE025311 למימון המעבדה שלנו כרגע.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch–neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
