Sortie d'imagerie Dpp d'un disque d'aile de Drosophila

Les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) sont essentielles pour l’embryogenèse précoce et le modelage des structures adultes. Les BMP sont produits et sécrétés pour affecter la transcription des gènes cibles nécessaires à la croissance et à la différenciation cellulaire dans les cellules qui répondent. Decapentaplegic (Dpp) est un homolog Drosophila de BMP4 qui est important pour le développement de structures embryonnaires et adultes comme l’aile^1,2,3^,4. Plusieurs groupes se sont concentrés sur le rôle de Dpp dans le modelage des ailes de mouche adultes parce que 1) les ailes sont composées de deux feuilles d’épithélie transparentes avec un modèle de vénérisation cohérent qui peut être facilement évalué; 2) les disques d’aile sont également raisonnablement plats, peuvent être cultivés en dehors de la larve, et sont simples à imager et quantifier les différences dans le modèle ; et 3) le développement du modèle d’aile est sensible à Dpp de telle sorte que de petites perturbations dans la voie auront un impact sur le modèle de vénation des ailes.

Dpp est produit dans des cellules situées dans la limite antérieure/postérieure du disque d’aile^5,6,7,8. Dpp se lie à un complexe de type 1 et de type 2 récepteurs de sérine/thréonine kinase^9,10. Sur la liaison Dpp, le récepteur de type 2 phosphoryle le récepteur de type 1 qui phosphorylate ensuite Mothers against Dpp (Mad), un homolog Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recrute un co-Smad supplémentaire (Médée), qui lui permet d’entrer dans le noyau où il régule les gènes cibles, conduisant à des effets en aval tels que la prolifération ou la différenciation^4,11.

Récemment, le Laboratoire Bates a montré que la libération incorrecte de Dpp dans le disque d’aile peut conduire à une diminution de la phosphorylation mad, la réduction de l’expression des gènes cibles, et les défauts de modelage des ailes^12,13. Plusieurs canaux ioniques ont un impact sur le développement de l’aile Drosophila et des structures associées^14,15. Ces canaux ioniques pourraient également être impliqués dans la version Dpp. Pour déterminer le mécanisme de la libération du morphogène, il est important qu’il existe une méthode pour visualiser les événements de libération.

Les Drs Aurelio Teleman et Stephen Cohen ont créé une protéine de fusion Dpp-GFP qui est capable de sauver la perte de Dpp, ce qui signifie qu’elle est biologiquement active et est libérée d’une manière biologiquement pertinente¹⁶. Ici, nous décrivons comment nous visualisons les événements de sortie Dpp à l’aide de ce Dpp-GFP. Cette protéine de fusion est particulièrement utile parce que le GFP est sensible au pH de telle sorte que lorsqu’il est dans les vésicules acides, la fluorescence est éteinte¹⁷. Par conséquent, lorsqu’une protéine étiquetée avec le GFP est libérée d’une vésicule dans l’environnement extracellulaire plus neutre, l’intensité de fluorescence de GFP augmente¹⁷. Nous avons profité de la sensibilité de pH de GFP pour déterminer si Dpp-GFP réside dans les vésicules acides. Nous avons photographié des disques d’aile exprimant Dpp-GFP avant et après l’ajout de chlorure d’ammonium, qui neutralise les vésicules des compartiments intracellulaires¹⁸. Nous avons constaté une augmentation significative de la fluorescence de la poncte après l’ajout de chlorure d’ammonium, suggérant que le Dpp-GFP intracellulaire soit éteint avant l’ajout de chlorure d’ammonium¹⁸. Nous concluons que le Dpp-GFP intracellulaire réside dans les compartiments membranaires acides, tels que les vésicules, et est non éteint à l’ajout de chlorure d’ammonium pour neutraliser le pH des compartiments intracellulaires¹⁸. Cela fait de l’imagerie en direct de Dpp-GFP une technique utile pour visualiser la dynamique de Dpp dans le disque d’aile Drosophila comme il est libéré des compartiments acides dans l’environnement extracellulaire.

Ici, nous décrivons la méthode que nous utilisons pour visualiser les événements de sortie Dpp à l’aide de Dpp-GFP. Dpp-GFP peut être exprimé dans son modèle natif dans les disques d’aile Drosophila en utilisant le système UAS-GAL4¹⁹. C’est la méthode qui a été utilisée pour déterminer que les canaux Irk impact Dpp communiqué¹⁸. Nous avons validé la méthode par des z-stacks en direct.imagerie. Nous ne voyons pas Dpp-GFP puncta se déplacer dans le plan de mise au point dans les séries chronologiques si nous avons acquis dans un plan de mise au point. Nous ne voyons pas non plus le mouvement de Dpp-GFP puncta si nous avons imaginé dans un z-stack. Nous concluons que la puncta dpp-GFP vue utilisant cette méthode sont des événements de libération plutôt que le mouvement des vésicules intracellulaires. Cette méthode d’imagerie en direct de Dpp-GFP pourrait potentiellement être utilisée pour tester d’autres modificateurs putatifs de la libération de Dpp pour leur impact sur la dynamique Dpp ou pourrait être modifiée pour examiner la dynamique d’autres ligands