Imaging DPP-release van een Drosophila -vleugel schijf

Botmorfogenetische eiwitten (BMPs) zijn essentieel voor de vroege embryogenese en het patroon van volwassen structuren. Bmp’s worden geproduceerd en uitgescheiden om de transcriptie te beïnvloeden van doel genen die nodig zijn voor groei en celdifferentiatie in reagerende cellen. Decapentaplegic (DPP) is een Drosophila homo van BMP4 dat belangrijk is voor de ontwikkeling van embryonale en volwassen structuren zoals de vleugel^1,2,3,4. Verschillende groepen hebben zich geconcentreerd op de rol van DPP in patronen Adult Fly Wings omdat 1) de vleugels bestaan uit twee transparante epitheelia vellen met een consistent venatie patroon dat gemakkelijk kan worden beoordeeld; 2) de vleugel schijven zijn ook redelijk plat, kunnen worden gekweekt buiten de larve, en zijn eenvoudig te beeld en kwantificeren verschillen in patroon; en 3) de vleugel patroon ontwikkeling is gevoelig voor DPP zodanig dat kleine verstoringen in het traject van invloed zijn op het vleugel nerven patroon.

DPP wordt geproduceerd in cellen die zich in de voorste/achterste grens van de vleugel schijf^5,6,7,8bevinden. DPP bindt aan een complex van type 1 en type 2 serine/Threonine kinase receptoren^9,10. Bij DPP binding, de type 2-receptor fosforyleert de type 1-receptor die vervolgens fosforyleert moeders tegen DPP (MAD), een smad 1/5/8 homolog. Gefosforyleerd SMAD rekruteert een extra co-smad (Medea), die het mogelijk maakt om naar de Nucleus te gaan waar het doel genen reguleert, wat leidt tot downstream effecten zoals proliferatie of differentiatie^4,11.

Onlangs heeft het Bates-laboratorium aangetoond dat de onjuiste afgifte van DPP binnen de vleugel schijf kan leiden tot een afname van de Mad fosforylering, vermindering van de doel-genexpressie en vleugel patronen van defecten^12,13. Verschillende ionenkanalen beïnvloeden de ontwikkeling van de Drosophila vleugel en bijbehorende structuren^14,15. Deze ionenkanalen kunnen ook worden betrokken bij de DPP-release. Bij het bepalen van het mechanisme van de morfogen release is het belangrijk dat er een methode is om vrijgave gebeurtenissen te visualiseren.

Drs. Aurelio Teleman en Stephen Cohen creëerde een DPP-GFP fusie-eiwit dat in staat is om verlies van DPP te redden, wat betekent dat het biologisch actief is en wordt vrijgegeven op een biologisch relevante manier¹⁶. Hier beschrijven we hoe we DPP release Events visualiseren met behulp van deze DPP-GFP. Dit fusie-eiwit is vooral nuttig omdat GFP pH-gevoelig is, zodat wanneer het in zure blaasjes is, de fluorescentie¹⁷wordt geblust. Daarom, wanneer een eiwit gelabeld met GFP is vrijgelaten uit een blaasje in de meer neutrale extracellulaire omgeving, GFP fluorescentie intensiteit stijgt¹⁷. We maakten gebruik van de pH-gevoeligheid van GFP om te bepalen of DPP-GFP zich in zure blaasjes bevindt. We afbeelding gemaakt vleugel schijven uitdrukken DPP-GFP voor en na de toevoeging van ammoniumchloride, die neutraliseert intracellulaire compartimenten blaasjes¹⁸. We vonden een significante toename van de fluorescentie van puncta na de toevoeging van ammoniumchloride, wat suggereert dat intracellulaire DPP-GFP wordt opge-blust vóór de toevoeging van ammoniumchloride¹⁸. We concluderen dat intracellulaire DPP-GFP zich in zure membraan-gebonden compartimenten bevindt, zoals blaasjes, en wordt ongeblust bij toevoeging van ammoniumchloride om de pH van intracellulaire compartimenten¹⁸te neutraliseren. Dit maakt live beeldvorming van DPP-GFP een bruikbare techniek om de dynamiek van DPP in de Drosophila-vleugel schijf te visualiseren, omdat deze uit zure compartimenten in de extracellulaire omgeving wordt vrijgegeven.

Hier beschrijven we de methode die we gebruiken om DPP-release-gebeurtenissen te visualiseren met behulp van DPP-GFP. DPP-GFP kan worden uitgedrukt in het oorspronkelijke patroon in Drosophila vleugel schijven met behulp van het UAS-GAL4 systeem¹⁹. Dit is de methode die werd gebruikt om te bepalen dat IRK kanalen invloed DPP release¹⁸. We hebben de methode gevalideerd door Live-Imaging z-stacks. We zien niet DPP-GFP puncta verplaatsen binnen het vlak van focus in time series als we in één vlak van focus verworven. We zien ook geen beweging van DPP-GFP puncta als we in een z-stack hebben gefotografeerd. We concluderen dat de DPP-GFP puncta gezien met behulp van deze methode release-gebeurtenissen in plaats van beweging van blaasjes intracellularly. Deze methode van Live-Imaging van DPP-GFP kan mogelijk worden gebruikt voor het testen van andere putatieve modifiers van DPP vrijlating voor hun impact op DPP dynamiek of kan worden aangepast om te kijken naar de dynamiek van andere liganden