Transcrições de RNA do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) em pacientes por RT-PCR específico
Summary
Grampos de cabelo rna e loops podem funcionar como primers para transcrição reversa (RT) na ausência de primers específicos da seqüência, interferindo com o estudo de transcrições antisense sobrepostas. Desenvolvemos uma técnica capaz de identificar rna específico da cadeia, e nós o usamos para estudar a proteína antisense HIV-1 ASP.
Abstract
Em retrovírus, a transcrição antisense tem sido descrita tanto no vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) quanto no vírus tinfotrópico T humano 1 (HTLV-1). No HIV-1, o gene asp de proteína antisense está localizado na vertente negativa da vv, no quadro de leitura -2, abrangendo a junção gp120/gp41. Na orientação de sentido, o final de 3′ do quadro de leitura aberta asp se sobrepõe com gp120 regiões hipervariáveis V4 e V5. O estudo do RNA ASP foi frustrado por um fenômeno conhecido como RT-auto-priming, em que as estruturas secundárias de RNA têm a capacidade de prime RT na ausência da cartilha específica, gerando cDNAs não específicos. O uso combinado de alta desnaturação de RNA com primers reversos biotinylated na reação rt, juntamente com a purificação de afinidade do cDNA em contas magnéticas revestidas de streptavidin, nos permitiu amplificar seletivamente RNA ASP em células T CD4 + derivadas de indivíduos infectados com HIV-1. Nosso método é relativamente de baixo custo, simples de executar, altamente confiável e facilmente reproduzível. A este respeito, representa uma ferramenta poderosa para o estudo da transcrição antisense não só no HIV-1, mas também em outros sistemas biológicos.
Introduction
O gene da proteína antisense (ASP) é um quadro de leitura aberto (ORF) localizado na cadeia negativa do gene do envelope tipo 1 (HIV-1) do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1), abrangendo a junção gp120/gp411. Nos últimos 30 anos, vários relatos mostraram que o gene HIV ASP é de fato transcrito e traduzido2,3,4,5,6,7,8,9. Embora as transcrições antisense asp tenham sido totalmente caracterizadas in vitro, até recentemente, as informações sobre a produção real de RNA ASP em pacientes ainda estavam faltando.
A seqüência de ASP é reversa e complementar ao env. Isso representa um grande obstáculo ao tentar detectar transcrições para ASP. Os métodos padrão de reação em cadeia de transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) usam primers antisenso específicos do gene para sintetizar DNAs complementares (CDNAs) da polaridade certa. Esta abordagem, no entanto, não permite determinar a orientação (sentido ou antisenso) do modelo inicial de RNA, uma vez que grampos de cabelo rna ou loops podem prime RT em ambas as direções, na ausência de primers10, um fenômeno conhecido como RT auto-priming. A maioria dos investigadores ASP contornar o problema da RT auto-priming usando primers marcados com seqüências que não estão relacionadas com o HIV-111,12. Esta estratégia, no entanto, não elimina a ocorrência do fenômeno, e pode levar a potencial recarga de cDNAs não específicas para o PCR11.
Recentemente desenvolvemos um novo ensaio RT-PCR específico da vertente para o estudo do RNA antisenso e o usamos para a detecção de RNA da ASP em uma coorte de seis pacientes infectados pelo HIV, como mostrado na Tabela 1. O procedimento descrito abaixo foi publicado anteriormente por Antonio Mancarella et al.13. Em nosso protocolo, evitamos a produção de CDNAs não específicos por uma abordagem dupla. Em primeiro lugar, eliminamos as estruturas secundárias de RNA desnatando rna a alta temperatura (94 °C) e, em segundo lugar, transcrevemos o RNA ASP usando uma cartilha específica de ASP biotinylated e purificam aafinidade do cDNA resultante. Por essa abordagem, somos capazes de amplificar apenas nosso cDNA alvo, uma vez que outros produtos RT não específicos são impedidos de serem gerados (desnaturação de alta temperatura de RNA) ou eliminados antes do PCR (purificação de afinidade).
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste relatório descrevemos um ensaio rt específico da cadeia aplicado à detecção de RNA ASP em células T CD4+ isoladas de indivíduos infectados pelo HIV-1. A ocorrência de escoramento não específico durante a RT dificulta a detecção de transcrições de RNA com a polaridade certa, levando à má interpretação dos resultados. Grupos anteriores desenvolveram várias estratégias destinadas a prevenir a síntese de CDNA independente durante a reação rt. Marcar a cartilha reversa no final do 3′ com sequênci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick e Matthieu Perreau por estarem sempre disponíveis para discutir nosso trabalho e todas as pessoas do Laboratório de Imunopatogenigenese da AIDS por sua preciosa assistência técnica. Também gostaríamos de agradecer a John e Aaron Weddle da VSB Associated Inc. que contribuíram com excelente arte. Finalmente, muito agradecimento especial a todos os pacientes, sem os quais este trabalho não teria sido possível. Este trabalho não recebeu nenhuma subvenção específica de qualquer agência de financiamento.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
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