Fare Beyninde Mikroglial Yoğunluk, Morfoloji ve Periferik Miyeloid Hücre Infiltrasyonu Analizi için IBA1 ve TMEM119 Kullanılarak İmmünofloresanS Boyama
Summary
Bu protokol, mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfolojinin yanı sıra fare beyin dokusunda periferik miyeloid hücre infiltrasyonunun analizine ek olarak, IBA1 ve TMEM119’un immünororesan costaining’i için adım adım iş akışını tanımlar.
Abstract
Bu mikroglia çift görselleştirme ve fare beyin dokusunda makrofajlar infiltrasyon için bir protokoldür. TMEM119 (mikrogliayı seçici olarak etiketler), IBA1 ile birlikte (morfolojilerinin olağanüstü bir görselleştirmesini sağlar), yoğunluk, dağılım ve morfolojideki değişikliklerin araştırılmasına olanak tanır. Bu parametrelerin ölçülmesi, beynin yerleşik makrofajları olan mikroglianın oynadığı rollere ilişkin içgörüler sağlamada önemlidir. Normal fizyolojik koşullar altında, mikroglia düzenli olarak mozaik benzeri bir desen dağıtılır ve ramified süreçleri ile küçük bir soma mevcut. Bununla birlikte, çevresel faktörlere (travma, enfeksiyon, hastalık veya yaralanma) yanıt olarak, mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfoloji hakarete bağlı olarak çeşitli şekillerde değiştirilmiştir. Ayrıca, açıklanan çift boyama yöntemi, IBA1 ekspresyonuna göre ve TMEM119 ile birlikte lokalizasyon olmadan beyindeki makrofajların görüntülenmesine olanak sağlar. Bu yaklaşım böylece mikroglia ve sızma makrofajlar arasında ayrımcılık sağlar, hangi sağlık ve hastalık çeşitli bağlamlarda beyin homeostaz onların farklı katılımı içine fonksiyonel anlayışlar sağlamak için gereklidir. Bu protokol, seçici belirteçlerin tanımlanması ile ilgili nöroimmünolojideki en son bulguları birleştirir. Aynı zamanda hem deneyimli nöroimmünolojistler hem de nöroimmünolojiyi projelere entegre etmek isteyen araştırmacılar için yararlı bir araç olarak hizmet vermektedir.
Introduction
Akut veya kronik olsun, nöroinflamasyon sıkı mikroglia etkilenir, beynin yerleşik makrofajlar. Mikroglianın immünoboyama yoluyla görselleştirilmesi, son derece erişilebilir bir teknik olan ışık mikroskobu kullanımı ile nöroinflamasyon çalışmaları için değerlidir. Homeostatik koşullarda, mikroglia genellikle örtüşmeyen, mozaik benzeri bir desen olarak dağıtılır. Onlar ramified süreçleri uzatmak küçük somassergilemek 1, bazen birbirlerine temas2. Mikroglial ramified süreçler dinamik beyin parankim anket, nöronlar ile etkileşim, diğer glial hücreler, ve normal fizyolojik koşullar sırasında kan damarları3. Mikroglia onları immünolojik görevleri gerçekleştirmek ve beyin ortamında değişikliklere yanıt sağlayan reseptörlerin bir cephanelik ile donatılmıştır, hücre ölümü, ya da doku hasarı. Buna ek olarak, özellikle sinaptik oluşum, bakım ve eleme4,5önemli fizyolojik fonksiyonlar uygulamak.
Mikroglia üzerinde kullanılan mevcut belirteçler arasında iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekül 1 (IBA1) en yaygın olarak kullanılanlardan biridir. IBA1, elektronmikroskobuile doğrulanan ince distal prosesler de dahil olmak üzere mikroglial morfolojinin olağanüstü görselleştirmesini sağlayan kalsiyum bağlayıcı bir proteindir 6. Bu araç mikroglial dönüşüm karakterize aracı olmuştur, eski olarak adlandırılan “aktivasyon”, hayvan hastalığı modelleri geniş bir dizi7,8,9. Nöroinflamasyon varlığında, mikroglial yanıt içerir: hücresel yoğunluk artışı olarak tanımlanan mikrogliozis, bazen kümeleme neden dağılım değişiklikleri, hücre gövdesinin genişlemesi, yanı sıra kalınlaşma ve daha ameboid şekiller ile ilişkili süreçlerin kısalması10,11,12,13.
İmmünoboyama belirli belirteçlere karşı yönlendirilen antikorların bulunabilirliği ile sınırlıdır. Daha da önemlisi, IBA1 mikroglia ile değil, aynı zamanda beyin14infiltrasyon periferik makrofajlar ile ifade edilir. Beyin içinde IBA1-pozitif hücrelerin gözlem bu araştırma alanında mikroglia bir belirteç haline gelmiştir iken, periferik makrofaj infiltrasyonu çeşitli koşullar altında bildirilmiştir, hatta marjinal sağlıklı beyin15,16 ,17,18. Sonuç olarak, Tek başına IBA1 kullanımı mikroglia seçici görselleştirme izin vermez. Buna ek olarak, makrofajlar, beyne sızdıktan sonra yerleşik mikroglianın moleküler ve morfolojik özelliklerini benimseyerek farklılaşmayı engellerler 19. Bu, hem mikroglianın işlevini araştırırken hem de makrofajlara sızarken bir zorluk teşkil eder.
Mikroglia ve periferik makrofajlar farklı kökenlere sahip olmakla birlikte (örneğin, embriyonik sarık kesesi ve kemik iliği, sırasıyla20,21), iki hücre popülasyonunun beyinde farklı roller19. Bu nedenle, bu iki popülasyon arasında yoğunluklarını, dağılımlarını, morfolojilerini ve işlevlerini modüle edebilen invaziv manipülasyonlar (kemik iliği kimeraları veya parabiyoz) olmadan ayrım yapan yöntemler kullanmak çok önemlidir. TMEM119 sağlık ve hastalık koşulları arasında mikroglia özgü bir belirteç olarak ortaya çıkmıştır22. IBA1 ile birleştirildiğinde, bu belirteç tmem119-negatif ve IBA1-pozitif makrofajlar, infiltrasyon bu hücrelerin ayırt etmek için yararlı olur. Bu gelişimsel olarak düzenlenmiş olsa da, TMEM119 doğum sonrası gün 3 (P3) ve 6 (P6) gibi erken olarak ifade edilir, sürekli P10 ve P1422arasında yetişkin seviyelerine ulaşana kadar artan . IBA1 embriyonik gün 10.5 (E10.5)23gibi erken ifade edilir. Önerilen çift etiketleme protokolü bu iki popülasyonun doğum sonrası yaşam boyunca incelenmesinde yararlıdır.
Bu protokol mikroglia ve periferik makrofajlar arasında ayrımcılık sağlayan bir adım-adım immünboyama prosedürü sağlar. Ayrıca mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfolojinin kantitatif analizinin yanı sıra periferik makrofaj infiltrasyonunun analizini de açıklar. Mikroglia ve periferik makrofajların araştırılması kendi başına yararlı olmakla birlikte, bu protokol nöroinflamatuar fuayelerin lokalizasyonuna daha da olanak sağlar; böylece, tamamlayıcı (henüz, daha fazla zaman ve kaynak tüketen) tekniklerin kullanımı ile, araştırmak için belirli bölgeleri belirlemek için bir platform olarak hizmet vermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol iki kritik bölüme ayrılabilir: boyama ve analiz kalitesi. Boyama optimal değilse, mikroglial hücreleri yeterince temsil etmek için başarısız olacak, böylece yoğunluk, dağılım ve morfoloji ölçümleri etkileyen. Buna ek olarak, infiltrasyon periferik miyeloid hücrelerin oranı hafife alınabilir. Bu boyama protokolünün en iyi leştirilmiş bir sürümüdür, ancak en uygun olmayan görüntülere neden olabilecek çeşitli etkenler vardır. Hayvanın perfüzyonu bu protokole dahil edilmese de,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nathalie Vernoux’a rehberlik ve deneylerdeki yardımları için minnettarız. Dr. Emmanuel Planel ve Serge Rivest’e floresan ve konfokal mikroskoplarını kullanmaları için de teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Meksika Bilim ve Teknoloji Konseyi (CONACYT; F.G.I), Fondation Famille-Choquette ve Centre thématique de recherche en neurosciences (TON; to K.P.), Fonds de Recherche du Québec – Santé (M.B.) ve Shastri Indo-Kanada Enstitüsü (K.B.’ye) yanı sıra Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi’nden (NSERC) M.E.T. M.E.T.’ye bir Discovery bursu, Sağlık ve Terapide Nöroimmün Plastisite Kanada Araştırma Başkanı ‘na (Tier II) sahiptir.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
- Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
- Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
- Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
- Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
- Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
- Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
- Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
- Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).
