Иммунофлуоресценция пятно использованием IBA1 и TMEM119 для микроглиальной плотности, морфологии и периферической миелоидной клеточной инфильтрации анализа в мышиный мозг
Summary
Этот протокол описывает пошаговой рабочий процесс для иммунофлуоресцентного костейни IBA1 и TMEM119, в дополнение к анализу микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также периферической миелоидной инфильтрации в ткани мозга мыши.
Abstract
Это протокол для двойной визуализации микроглии и проникновения макрофагов в ткани мозга мыши. TMEM119 (который маркирует микроглию выборочно), в сочетании с IBA1 (который обеспечивает исключительную визуализацию их морфологии), позволяет исследует изменения плотности, распределения и морфологии. Количественная оценка этих параметров имеет важное значение для получения информации о роли, которую играет микроглия, резидентные макрофаги мозга. В нормальных физиологических условиях микроглия регулярно распределяется по мозаичному узору и представляет собой небольшую сому с беспорядочными процессами. Тем не менее, в ответ на экологические факторы (наиболее травмы, инфекции, болезни или травмы), микроглиальная плотность, распределение и морфология изменяются различными способами, в зависимости от оскорбления. Кроме того, описанный метод двойного окрашивания позволяет визуализировать проникновение макрофагов в мозг на основе их экспрессии IBA1 и без колокализации с TMEM119. Таким образом, такой подход позволяет проводить дискриминацию между микроглией и инфильтративающимися макрофагами, что необходимо для обеспечения функционального понимания их явного участия в гомеостазе мозга в различных контекстах здоровья и болезней. Этот протокол интегрирует последние выводы в нейроиммунологии, которые относятся к идентификации селективных маркеров. Он также служит полезным инструментом как для опытных нейроиммунологов, так и для исследователей, стремящихся интегрировать нейроиммунологию в проекты.
Introduction
Будь то острое или хроническое, нейровоспаление находится под сильным влиянием микроглии, резидентов макрофагов мозга. Визуализация микроглии с помощью иммуностоинга ценна для изучения нейровоспаления с использованием световой микроскопии, высокодоступной техники. В гомеостастатных условиях, микроглии, как правило, распространяются в nonoverlapping, мозаика, как картина. Они проявляют небольшие сомы, которые расширяют неразрешимые процессы1, которые иногда контактируют друг с другом2. Микроглиальные неразрежденные процессы динамически обследуют паренхиму головного мозга, взаимодействуя с нейронами, другими глиальными клетками и кровеносными сосудами при нормальных физиологических условиях3. Микроглия оснащена арсеналом рецепторов, которые позволяют им выполнять иммунологические задачи и реагировать на изменения в среде мозга, на гибель клеток или на повреждение тканей. Кроме того, они оказывают ключевые физиологические функции, в частности, в синаптической формирования, технического обслуживания и ликвидации4,5.
Среди доступных маркеров, используемых для изучения микроглии, ионизированная молекула адаптера связывания кальция 1 (IBA1) является одним из наиболее широко используемых. IBA1 является кальциевым связывающим белком, который обеспечивает исключительную визуализацию микроглиальной морфологии, включая тонкие дистальные процессы, что подтверждается электронной микроскопией6. Этот инструмент сыграл важную роль в характеристике микроглиальной трансформации, ранее называемой “активацией”, в широком спектре моделей болезней животных7,8,9. При наличии нейровоспаления микроглиальный ответ включает в себя: микроглиоз, который определяется как увеличение плотности клеток, изменения в распределении, которые иногда приводят к кластеризации, увеличению тела клетки, а также утолщение и сокращение процессов, связанных с более амибойдформы10,11,12,13.
Иммуностогирование ограничено наличием антител, направленных против конкретных маркеров. Важно отметить, что IBA1 выражается в микроглии, но и периферических макрофагов, которые проникают в мозг14. В то время как наблюдение IBA1-положительных клеток внутри мозга стало маркером микроглии в этой области исследований, периферийные инфильтрации макрофагов было сообщено в различных условиях, даже незначительно в здоровом мозге15,16 ,17,18. Следовательно, использование IBA1 само по себе не позволяет селективной визуализации микроглии. Кроме того, макрофаги принимают молекулярно-морфологические особенности резидентов микроглии, как только они проникли в мозг, тем самым препятствуя дифференциации19. Это представляет собой проблему при изучении функции как микроглии, так и инфильтрации макрофагов.
В то время как микроглии и периферических макрофагов имеют четкое происхождение (например, от эмбрионального желтка мешок и костный мозг, соответственно20,21), есть все большее число выводов, указывающих, что две популяции клеток оказывают различные роли в мозге19. Поэтому крайне важно использовать методы, которые различают эти две популяции без инвазивных манипуляций (т.е. химер костного мозга или парабиоза), которые могут модулировать их плотность, распределение, морфологию и функции. TMEM119 стал микроглии конкретных маркера через здоровье и болезни условия22. В сочетании с IBA1, этот маркер становится полезным для дифференциирования этих клеток от проникновения макрофагов, которые TMEM119-отрицательный и IBA1-положительный. Хотя это регулируется в развитии, TMEM119 выражается уже в послеродовые дни 3 (P3) и 6 (P6), неуклонно растет до достижения взрослых уровней между P10 и P1422. IBA1 выражается уже в эмбриональный день 10.5 (E10.5)23. Таким образом, предлагаемый протокол двойной маркировки полезен для изучения этих двух популяций на протяжении всей послеродовой жизни.
Этот протокол обеспечивает пошаговую иммуностоинизационную процедуру, которая допускает дискриминацию между микроглией и периферийными макрофагами. В нем также объясняется, как проводить количественный анализ микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также анализ инфильтрации периферических макрофагов. В то время как исследование микроглии и периферических макрофагов полезно само по себе, этот протокол далее позволяет локализацию нейровоспалительных фойе; таким образом, он также служит платформой для определения конкретных регионов для проведения расследований с использованием дополнительных (пока больше времени и затрат) методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол можно разделить на две критические части: качество окрашивания и анализа. Если окрашивание не является оптимальным, оно не сможет представлять микроглиальные клетки адекватно, тем самым влияя на плотность, распределение и измерения морфологии. Кроме того, доля инфильтра?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Натали Верно за ее руководство и помощь в проведении экспериментов. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Эммануэль Планель и Серж Ривест за использование их флуоресценции и конфокальных микроскопов, соответственно. Эта работа частично финансировалась за счет стипендий От Мексиканского совета по науке и технике (CONACYT; F.G.I), Фонда Фамиль-Чокетт и Центра тематика де речерче-н-р неврологии (CTRN; к К.П.), Фонды де Рехерче дю Квебек – Санте (до М.Б.), и Шастри Индо-канадский институт (к KB), а также Грант Discovery от естественных наук и инженерных исследований Совета Канады (NSERC) в M.E.T. M.E.T. имеет канадский научно-исследовательский кафедры (Tier II) нейроиммунной пластичности в области здравоохранения и терапии.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
- Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
- Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
- Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
- Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
- Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
- Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
- Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
- Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).
