Immunofluorescenza Colorazione utilizzando IBA1 e TMEM119 per densità microgliale, morfologia e infiltrazione delle cellule mieloidi periferiche nel cervello del mouse

Che sia acuta o cronica, la neuroinfiammazione è strettamente influenzata dalla microglia, i macrofagi residenti del cervello. La visualizzazione della microglia attraverso l’immunostaining è preziosa per lo studio della neuroinfiammazione con l’uso della microscopia leggera, una tecnica altamente accessibile. In condizioni omeostatiche, la microglia è tipicamente distribuita in un modello non sovrapponi, simile a un mosaico. Essi esibiscono piccoli somas che estendono processi ramificati¹, che a volte si contattano^l’unl’altro 2 . I processi microgliali ramificati esaminano dinamicamente il parenchyma cerebrale, interagendo con neuroni, altre cellule gliali e vasi sanguigni durante le normali condizioni fisiologiche³. Le microglia sono dotate di un arsenale di recettori che consentono loro di eseguire compiti immunologici e rispondere ai cambiamenti nell’ambiente cerebrale, alla morte cellulare o ai danni ai tessuti. Inoltre, esercitano funzioni fisiologiche chiave, in particolare nella formazione sinaptica, manutenzione, ed eliminazione^4,5.

Tra i marcatori disponibili utilizzati per studiare la microglia, l’adattatore legante di calcio ionizzato molecola 1 (IBA1) è uno dei più utilizzati. IBA1 è una proteina legante di calcio che fornisce una visualizzazione eccezionale della morfologia microgliale, compresi i processi distale fini, come confermato dalla microscopia elettronica⁶. Questo strumento è stato determinante nella caratterizzazione della trasformazione microgliale, precedentemente chiamata “attivazione”, in una vasta gamma di modelli di malattie animali^7,8,9. In presenza di neuroinfiammazione, la risposta microgliale comprende: microgliosi che è definita come un aumento della densità cellulare, cambiamenti nella distribuzione che a volte si traducono in clustering, allargamento del corpo cellulare, così come ispessimento e ispessimento e accorciamento dei processi associati a più forme ameboide^10,11,12,13.

L’immunostaining è limitato dalla disponibilità di anticorpi diretti contro marcatori specifici. È importante sottolineare che IBA1 è espresso dalla microglia ma anche dai macrofagi periferici che si infiltrano nel cervello¹⁴. Mentre l’osservazione delle cellule iBA1 positive all’interno del cervello è diventata un marcatore di microglia in questo campo di ricerca, l’infiltrazione di macrofagi periferici è stata segnalata in varie condizioni, anche marginalmente nel cervello sano^{15,16 ,17,18}. Di conseguenza, l’uso di IBA1 da solo non consente la visualizzazione selettiva della microglia. Inoltre, i macrofagi adottano caratteristiche molecolari e morfologiche della microglia residente una volta che si sono infiltrati nel cervello, ostacolando così la differenziazione¹⁹. Questo rappresenta una sfida quando si studia la funzione della microglia e dell’infiltrazione dei macrofagi.

Mentre le microglia e i macrofagi periferici hanno origini distinte (ad esempio, dal sacco del tuorlo embrionale e dal midollo osseo, rispettivamente^20,21), vi è un numero crescente di rilievi che indicano che le due popolazioni di cellule esercitano diversi ruoli nel cervello¹⁹. È quindi fondamentale utilizzare metodi che discriminano tra queste due popolazioni senza manipolazioni invasive (cioè chimere di midollo osseo o parabiosi) che possono modularne la densità, la distribuzione, la morfologia e la funzione. Il TMEM119 è emerso come un marcatore specifico della microglia in tutte le condizioni di salute e malattia²². In combinazione con IBA1, questo marcatore diventa utile per differenziare queste cellule dall’infiltrazione di macrofagi, che sono TMEM119-negativi e IBA1-positivi. Mentre è regolamentato dal punto di vista dello sviluppo, TMEM119 è espresso già nei giorni postnatali 3 (P3) e 6 (P6), in costante aumento fino a raggiungere i livelli degli adulti tra P10 e P14²². IBA1 è espresso già come giorno embrionale 10.5 (E10.5)²³. Il protocollo di doppia etichettatura proposto è quindi utile per studiare queste due popolazioni per tutta la vita postnatale.

Questo protocollo fornisce una procedura di immunostaining passo-passo che consente la discriminazione tra microglia e macrofagi periferici. Spiega anche come condurre un’analisi quantitativa della densità microgliale, della distribuzione e della morfologia, nonché un’analisi dell’infiltrazione dei macrofaghi periferici. Mentre lo studio di microglia e macrofagi periferici è utile da solo, questo protocollo consente ulteriormente la localizzazione di foyer neuroinfiammatori; quindi, serve anche come piattaforma per identificare aree specifiche da studiare, con l’uso di tecniche complementari (ancora, più dispendiose in termini di tempo e risorse).