Immunofluorescence צביעת באמצעות IBA1 ו TMEM119 עבור צפיפות Microglial, מורפולוגיה וניתוח הסתננות מיאלואידית תא היקפית במוח העכבר
Summary
פרוטוקול זה מתאר את תהליך העבודה צעד אחר צעד עבור אימונוofluoroocoooooooiood של IBA1 ו TMEM119, בנוסף ניתוח של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם חדירת תאים מיאלואידית היקפית ברקמת המוח העכבר.
Abstract
זהו פרוטוקול עבור הדמיה כפולה של מיקרוגלייה והסתננות מקרופאגים ברקמת המוח של העכבר. TMEM119 (אשר מדבקות מיקרוגלייה באופן סלקטיבי), כאשר בשילוב עם IBA1 (אשר מספק הדמיה יוצאת דופן של המבנה שלהם), מאפשר חקירה של שינויים צפיפות, הפצה, מורפולוגיה. לכמת את הפרמטרים הללו חשוב במתן תובנות לתוך התפקידים שהופעלו על ידי microglia, מקרופאגים המתמחים של המוח. בתנאים פיסיולוגיים נורמליים, מיקרוגלייה מופצים באופן קבוע בדפוס כמו פסיפס ולהציג סומה קטנה עם תהליכים מסויד. עם זאת, כתגובה לגורמים סביבתיים (קרי, טראומה, זיהום, מחלה או פציעה), צפיפות microglial, הפצה ומורפולוגיה משתנות בנימוסים שונים, בהתאם לעלבון. בנוסף, השיטה המתוארת כפולה כפולות מאפשר ויזואליזציה של הסתננות מקרופאגים במוח מבוסס על הביטוי שלהם IBA1 וללא התאמה לשפות אחרות עם TMEM119. גישה זו מאפשרת הפליה בין מיקרוגלייה והסתננות מקרופאגים, אשר נדרש כדי לספק תובנות תפקודית למעורבות שלהם ברורים הומאוסטזיס המוח על פני ההקשרים השונים של בריאות ומחלות. פרוטוקול זה משלב את הממצאים העדכניים ביותר נוירואימונולוגיה הנוגעת לזיהוי של סמנים סלקטיבית. הוא משמש גם כלי שימושי עבור נוירואימונוולוגים מנוסים וחוקרים המבקשים לשלב נוירואימונולוגיה לפרויקטים.
Introduction
אם אקוטי או כרוני, דלקת נוירו מושפע היטב על ידי microglia, מקרופאגים התושב של המוח. המחשה של מיקרוגלייה באמצעות כתמים חיסוני הוא בעל ערך למחקר של דלקת מוחי עם שימוש של מיקרוסקופ אור, טכניקה נגישה מאוד. בתנאים הומסטטיים, מיקרוגלייה מופצים בדרך כלל בתבנית ללא חפיפה, כמו פסיפס. הם מציגים מנות קטנות שמרחיבות את התהליכים הללו1, אשר לעיתים מגעיםאחד לשני. תהליכים מיקרוסקופיים מיקרוגליאל באופן דינמי לסקר את המוח בתוך מכימומה, אינטראקציה עם נוירונים, תאים גליה אחרים, וכלי דם במהלך מצבים פיזיולוגיים נורמליים3. Microglia מצוידים בארסנל של קולטנים המאפשרים להם לבצע משימות אימונולוגיים להגיב לשינויים בתחומי המוח, למוות בתאים, או לנזק לרקמות. בנוסף, הם להפעיל פונקציות פיזיולוגיות מפתח, בעיקר היווצרות סינפטית, תחזוקה, וביטול4,5.
בין הסמנים הזמינים המשמשים לחקר microglia, כריכת סידן כריכה מתאם מולקולה 1 (IBA1) הוא אחד הנפוצים ביותר. IBA1 הוא חלבון מחייב סידן המספק הדמיה יוצאת דופן של מורפולוגיה microglial, כולל תהליכים בסדר המרוחק, כפי שאושרו על ידי אלקטרון מיקרוסקופ6. כלי זה היה אינסטרומנטלי באפיון טרנספורמציה microglial, שנקרא בעבר “הפעלה”, במערך עצום של מחלת בעלי חיים מודלים7,8,9. בנוכחות של דלקת ניווניות, התגובה microglial כוללת: microglial המוגדר כגידול בצפיפות הסלולר, שינויים בהפצה כי לפעמים כתוצאה באשכולות, הגדלה של גוף התא, כמו גם עיבוי ו קיצור של תהליכים המשויכים לצורות מסוימות של מאמתיבה10,11,12,13.
כתמים חיסוני מוגבל על ידי הזמינות של נוגדנים בבימויו של סמנים ספציפיים. חשוב מכך, IBA1 מתבטא על ידי מיקרוגלייה אבל גם על ידי מקרופאגים היקפיים שיסתננו את המוח14. בעוד התבוננות של תאים IBA1-חיוביים בתוך המוח הפך סמן של מיקרוגלייה בתחום זה מחקר, הסתננות מקרופאג היקפית דווחה בתנאים שונים, אפילו שולית במוח בריא15,16 ,17,18. כתוצאה מכך, השימוש IBA1 לבדו אינו מאפשר ויזואליזציה סלקטיבית של microglia. בנוסף, מקרופאגים לאמץ תכונות מולקולריות ומורפולוגיות של מיקרוגליה תושב ברגע שהם חדרו למוח, ובכך בידול19. זה מייצג אתגר בעת חקירת הפונקציה של שני מיקרוגלייה ו הסתננות מקרופאגים.
בעוד מיקרוגלייה ו מקרופאגים היקפיים יש מקורות ברורים (למשל, מן שק החלמון העובריים ואת מח העצם, בהתאמה20,21), יש מספר גדל והולך של ממצאים המציינים כי שתי אוכלוסיות תאים להפעיל תפקידים שונים במוח19. לפיכך, חיוני להשתמש בשיטות ההפלות בין שתי האוכלוסיות הללו ללא מניפולציות פולשניות (כלומר, מקרי מח עצם או parabiosis) שיכולים לווסת את הצפיפות, ההפצה, המבנה והתפקוד שלהם. TMEM119 התפתחה כסמן ספציפי microglia על פני בריאות ומחלות בתנאים22. בשילוב עם IBA1, סמן זה הופך להיות שימושי להבדיל תאים אלה מן הסתננות מקרופאגים, שהם TMEM119-שליליים ו IBA1-חיובית. למרות שהוא מוסדר באופן מנטלי, TMEM119 מתבטא כבר בימים אחרי הלידה 3 (P3) ו 6 (P6), הגדלת בהתמדה עד להגיע לרמות מבוגרים בין P10 ו P1422. IBA1 מתבטאת מוקדם כמו יום עובריים 10.5 (E 10.5)23. פרוטוקול תיוג כפול המוצע שימושי ובכך לחקור את שתי האוכלוסיות הללו במהלך החיים לאחר הלידה.
פרוטוקול זה מספק הליך חיסוני צעד אחר צעד המאפשר אפליה בין מיקרוגלייה ומקרופאגים היקפיים. זה גם מסביר כיצד לבצע ניתוח כמותי של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם ניתוח של הסתננות מקרופאג היקפית. בעוד החקירה של מיקרוגלייה ו מקרופאגים היקפיים הוא שימושי משלו, פרוטוקול זה עוד מאפשר לוקליזציה של מייבשי נוירודלקתיות; לפיכך, היא משמשת גם כפלטפורמה לזיהוי אזורים מסוימים כדי לחקור, עם שימוש בטכניקות משלימות (עדיין, זמן רב יותר וצורכת משאבים).
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה ניתן לחלק בשני חלקים קריטיים: איכות ההכתמים והניתוח. אם הצביעת אינו אופטימלי, הוא ייכשל לייצג תאים microglial כראוי, ובכך להשפיע על צפיפות, הפצה, ומורפולוגיה מדידות. בנוסף, הפרופורציה של תאים מיאלואיד היקפית היקפיים עלול להיות לא מזלזל. זוהי גירסה ממוטבת של פרוטוקול ההכתמים, אך ישנם …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לנטלי ורנוקס על הדרכתו ועזרתה בניסויים. בנוסף, אנו רוצים להודות לד”ר עמנואל פלאמל וסרג ‘ ריבסט לשימוש הקרינה הפלואורסצנטית והקונקמיקרוסקופים שלהם, בהתאמה. עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי מלגות מהמועצה המקסיקנית למדע וטכנולוגיה (conacyt; ל-F. G. I), fondation famille-צ’קט ומרכז תימטאקה דה רצ’רצ’ה en מדעי המוח (ctrn; כדי K.P.), כפות דה מחקר du קוויבק-סאנטא (כדי מ ב), ו שתיל הודו-קנדי המכון (כדי K.B.), כמו גם מענק דיסקברי ממדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה של קנדה (NSERC) כדי M.E.T. M.E.T. מחזיקה כסא מחקר בקנדה (Tier II) של נוירוטיקה החיסונית בריאות וטיפול.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
- Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
- Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
- Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
- Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
- Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
- Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
- Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
- Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).
