Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen schrittweisen Workflow für die immunfluoreszierende Costainierung von IBA1 und TMEM119, zusätzlich zur Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie der peripheren myeloischen Zellinfiltration im Gehirngewebe der Maus.
Abstract
Dies ist ein Protokoll zur dualen Visualisierung von Mikroglia und infiltrierenden Makrophagen im Gehirngewebe der Maus. TMEM119 (das Mikroglia selektiv kennzeichnet), in Kombination mit IBA1 (das eine außergewöhnliche Visualisierung ihrer Morphologie bietet) ermöglicht die Untersuchung von Veränderungen in Dichte, Verteilung und Morphologie. Die Quantifizierung dieser Parameter ist wichtig, um Einblicke in die Rolle zu geben, die von Mikroglia, den ansässigen Makrophagen des Gehirns, ausgeübt wird. Unter normalen physiologischen Bedingungen werden Mikroglia regelmäßig in einem mosaikartigen Muster verteilt und stellen ein kleines Soma mit verzweigten Prozessen dar. Als Reaktion auf Umweltfaktoren (z. B. Trauma, Infektion, Krankheit oder Verletzung) werden mikrogliaale Dichte, Verteilung und Morphologie je nach Beleidigung auf unterschiedliche Weise verändert. Darüber hinaus ermöglicht die beschriebene Doppelfärbungsmethode die Visualisierung von infiltrierenden Makrophagen im Gehirn basierend auf ihrer Expression von IBA1 und ohne Kolokalisierung mit TMEM119. Dieser Ansatz ermöglicht somit die Diskriminierung zwischen Mikroglia und infiltrierenden Makrophagen, die erforderlich ist, um funktionelle Einblicke in ihre ausgeprägte Beteiligung an der Homöostase des Gehirns in verschiedenen Kontexten von Gesundheit und Krankheit zu geben. Dieses Protokoll integriert die neuesten Erkenntnisse in der Neuroimmunologie, die sich auf die Identifizierung selektiver Marker beziehen. Es dient auch als nützliches Werkzeug für erfahrene Neuroimmunologen und Forscher, die Neuroimmunologie in Projekte integrieren möchten.
Introduction
Ob akut oder chronisch, Neuroinflammation wird stark durch Mikroglia beeinflusst, die ansässigen Makrophagen des Gehirns. Die Visualisierung von Mikroglia durch Immunfärbung ist wertvoll für die Untersuchung von Neuroinflammation mit dem Einsatz der Lichtmikroskopie, einer hochzugänglichen Technik. Bei homeostatischen Bedingungen werden Mikroglia in der Regel in einem nicht überlappenden, mosaikartigen Muster verteilt. Sie zeigen kleine Somas, die verzweigte Prozesse erweitern1, die manchmal miteinander in Kontakt treten2. Mikrogliale verzweigte Prozesse vermessen dynamisch das Blutparenchym und interagieren mit Neuronen, anderen Gliazellen und Blutgefäßen während normaler physiologischer Bedingungen3. Microglia sind mit einem Arsenal von Rezeptoren ausgestattet, die es ihnen ermöglichen, immunologische Aufgaben auszuführen und auf Veränderungen im Gehirnmilieu, auf Zelltod oder Gewebeschäden zu reagieren. Darüber hinaus üben sie wichtige physiologische Funktionen aus, insbesondere in der synaptischen Bildung, Wartung und Elimination4,5.
Unter den verfügbaren Markern, die zur Untersuchung von Mikroglia verwendet werden, ist das ionisierte Calciumbindungsadaptermolekül 1 (IBA1) eines der am häufigsten verwendeten. IBA1 ist ein Kalzium-bindendes Protein, das eine außergewöhnliche Visualisierung der mikroglialen Morphologie, einschließlich feiner distaler Prozesse, bietet, wie durch Elektronenmikroskopie6bestätigt wird. Dieses Tool war maßgeblich an der Charakterisierung der mikrogliaalen Transformation, früher als “Aktivierung” bezeichnet, in einer Vielzahl von Tierseuchenmodellen7,8,9. In Gegenwart von Neuroinflammation, die mikrogliaale Reaktion umfasst: Mikrogliase, die als eine Erhöhung der Zelldichte definiert ist, Veränderungen in der Verteilung, die manchmal zu Clustering führen, Vergrößerung des Zellkörpers, sowie Verdickung und Verkürzung der Prozesse, die mit mehr Ameboidformen verbunden sind10,11,12,13.
Die Immunfärbung wird durch die Verfügbarkeit von Antikörpern begrenzt, die gegen bestimmte Marker gerichtet sind. Wichtig ist, dass IBA1 durch Mikroglia, aber auch durch periphere Makrophagen ausgedrückt wird, die das Gehirn infiltrieren14. Während die Beobachtung von IBA1-positiven Zellen im Gehirn zu einem Marker von Mikroglia in diesem Forschungsgebiet geworden ist, wurde die periphere Makrophageninfiltration unter verschiedenen Bedingungen berichtet, sogar geringfügig im gesunden Gehirn15,16 ,17,18. Folglich erlaubt die Verwendung von IBA1 allein keine selektive Visualisierung von Mikroglia. Darüber hinaus übernehmen Makrophagen molekulare und morphologische Merkmale der ansässigen Mikroglia, sobald sie das Gehirn infiltriert haben, wodurch die Differenzierung behindert wird19. Dies stellt eine Herausforderung bei der Untersuchung der Funktion sowohl der Mikroglia als auch der Infiltrierung von Makrophagen dar.
Während Mikroglia und periphere Makrophagen unterschiedliche Ursprünge haben (z. B. aus dem embryonalen Eigelbsack bzw.20,21), gibt es immer mehr Befunde, die darauf hindeuten, dass die beiden Zellpopulationen verschiedene Rollen im Gehirn19. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, Methoden zu verwenden, die zwischen diesen beiden Populationen ohne invasive Manipulationen (d. h. Knochenmarkchimeren oder Parabiose) unterscheiden, die ihre Dichte, Verteilung, Morphologie und Funktion modulieren können. TMEM119 hat sich als mikrogliaspezifischer Marker für Gesundheit und Krankheit sprägsiert22. In Kombination mit IBA1 wird dieser Marker nützlich, um diese Zellen von infiltrierenden Makrophagen zu unterscheiden, die TMEM119-negativ und IBA1-positiv sind. Während es entwicklungsreguliert ist, wird TMEM119 bereits in den postnatalen Tagen 3 (P3) und 6 (P6) ausgedrückt und steigt stetig an, bis das Erwachsenenniveau zwischen P10 und P1422erreicht wird. IBA1 wird bereits am embryonalen Tag 10.5 (E10.5)23ausgedrückt. Das vorgeschlagene Doppelkennzeichnungsprotokoll ist daher nützlich, um diese beiden Populationen während des gesamten postnatalen Lebens zu untersuchen.
Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Immunstaining-Verfahren, das eine Diskriminierung zwischen Mikroglia und peripheren Makrophagen ermöglicht. Außerdem wird erläutert, wie eine quantitative Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie die Analyse der peripheren Makrophageninfiltration durchgeführt werden kann. Während die Untersuchung von Mikroglia und peripheren Makrophagen allein nützlich ist, ermöglicht dieses Protokoll weiterhin die Lokalisierung neuroinflammatorischer Foyers; Daher dient es auch als Plattform, um bestimmte zu untersuchende Regionen zu identifizieren, wobei ergänzende (noch zeit- und ressourcenverbrauchende) Techniken verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll kann in zwei kritische Teile unterteilt werden: Qualität der Färbung und Analyse. Wenn die Färbung nicht optimal ist, wird sie mikrogliaale Zellen nicht angemessen darstellen, was die Dichte-, Verteilungs- und Morphologiemessungen beeinflusst. Darüber hinaus kann der Anteil der infiltrationsperipheren myeloischen Zellen unterschätzt werden. Dies ist eine optimierte Version des Färbeprotokolls, aber es gibt mehrere Faktoren, die zu suboptimalen Bildern führen können. Auch wenn die Durchblutung des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Nathalie Vernoux für ihre Anleitung und Unterstützung bei den Experimenten. Wir danken auch Drs. Emmanuel Planel und Serge Rivest für den Einsatz ihrer Fluoreszenz- bzw. Konfokalmikroskope. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Stipendien des Mexican Council of Science and Technology (CONACYT; to F.G.I), Fondation Famille-Choquette und Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; to K.P.), Fonds de Recherche du Québec – Santé (zu M.B.) und Shastri Indo-Canadian Institute (zu K.B.) sowie ein Discovery-Stipendium des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) an M.E.T. M.E.T. hält einen Canada Research Chair (Tier II) of Neuroimmune Plasticity in Health and Therapy.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
- Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
- Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
- Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
- Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
- Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
- Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
- Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
- Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).
