Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen
Summary
Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.
Abstract
Dit is een protocol voor de dubbele visualisatie van Microglia en infiltrerende macrofagen in muis hersenweefsel. TMEM119 (welke labels Microglia selectief), in combinatie met IBA1 (die een uitzonderlijke visualisatie van hun morfologie biedt), maakt onderzoek mogelijk van veranderingen in dichtheid, distributie en morfologie. Het kwantificeren van deze parameters is belangrijk om inzicht te geven in de rollen die worden uitgeoefend door Microglia, de ingezeten macrofagen van de hersenen. Onder normale fysiologische omstandigheden worden Microglia regelmatig verdeeld in een mozaïek achtig patroon en presenteren ze een klein SOMA met vertakte processen. Niettemin, als reactie op omgevingsfactoren (dat wil zeggen, trauma, infectie, ziekte, of letsel), microgliale dichtheid, verdeling, en morfologie worden gewijzigd op verschillende manieren, afhankelijk van de belediging. Bovendien maakt de beschreven methode voor dubbele kleuring visualisatie mogelijk van infiltrerende macrofagen in de hersenen op basis van hun expressie van IBA1 en zonder colokalisatie met TMEM119. Deze aanpak maakt het mogelijk discriminatie tussen Microglia en infiltrerende macrofagen, die nodig is om functionele inzichten in hun duidelijke betrokkenheid bij hersenen homeostase over verschillende contexten van gezondheid en ziekte te bieden. Dit protocol integreert de nieuwste bevindingen in Neuro immunologie die betrekking hebben op de identificatie van selectieve markers. Het fungeert ook als een nuttig hulpmiddel voor zowel ervaren neuro immunologen als onderzoekers die Neuro immunologie willen integreren in projecten.
Introduction
Of acute of chronische, neuro ontsteking wordt nauw beïnvloed door Microglia, de ingezeten macrofagen van de hersenen. Het visualiseren van Microglia door middel van immunokleuring is waardevol voor de studie van neuro ontsteking met het gebruik van lichte microscopie, een zeer toegankelijke techniek. In homeostatische omstandigheden worden Microglia meestal verdeeld in een niet-overlappend, mozaïek achtig patroon. Ze vertonen kleine soma’s die vertakte processen uitbreiden1, die soms contact met elkaar2. Microglial vertakte processen dynamisch onderzoek van de hersen parenchym, interactie met neuronen, andere gliacellen en bloedvaten tijdens normale fysiologische omstandigheden3. Microglia zijn uitgerust met een arsenaal aan receptoren die hen in staat stellen om immunologische taken uit te voeren en te reageren op veranderingen in de hersen milieu, op celdood of op weefselbeschadiging. Bovendien, zij uitoefenen belangrijke fysiologische functies, met name in synaptische vorming, onderhoud, en eliminatie4,5.
Onder de beschikbare markers die worden gebruikt om Microglia te bestuderen, is geïoniseerde calcium bindings adapter molecuul 1 (IBA1) een van de meest gebruikte. IBA1 is een calcium bindend eiwit dat een uitzonderlijke visualisatie van microgliale morfologie biedt, inclusief fijne distale processen, zoals bevestigd door elektronenmicroscopie6. Deze tool heeft een belangrijke rol gespeeld bij het karakteriseren van microglial transformatie, voorheen “Activation” genoemd, in een breed scala aan dierziekte modellen7,8,9. In aanwezigheid van neuro ontsteking omvat de microglial respons: microgliosis die wordt gedefinieerd als een toename in cellulaire dichtheid, veranderingen in de distributie die soms resulteren in Clustering, vergroting van het cellichaam, evenals verdikking en verkorting van processen in verband met meer ameboid vormen10,11,12,13.
Immunokleuring wordt beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen gericht tegen specifieke markers. Belangrijk is dat IBA1 wordt uitgedrukt door Microglia, maar ook door perifere macrofagen die de hersenen ininfiltreren14. Terwijl observatie van IBA1-positieve cellen in de hersenen een marker van Microglia is geworden in dit onderzoeksveld, is perifere macrofaag infiltratie gemeld onder verschillende omstandigheden, zelfs marginaal in het gezonde brein15,16 ,17,18. Bijgevolg is het gebruik van IBA1 alleen niet toegestaan voor selectieve visualisatie van Microglia. Daarnaast nemen macrofagen moleculaire en morfologische kenmerken van Resident Microglia aan zodra ze de hersenen hebben geïnfiltreerd, waardoor differentiatie19wordt belemmerd. Dit vormt een uitdaging bij het onderzoeken van de functie van zowel Microglia als infiltrerende macrofagen.
Hoewel Microglia en perifere macrofagen verschillende oorzaken hebben (bijv. uit de embryonale dooierzak en het beenmerg, respectievelijk20,21), is er een toenemend aantal bevindingen waaruit blijkt dat de twee celpopulaties verschillende rollen in de hersenen19. Het is dus van cruciaal belang om methoden te gebruiken die discrimineren tussen deze twee populaties zonder invasieve manipulaties (d.w.z. beenmerg chimeras of parabiose) die hun dichtheid, verdeling, morfologie en functie kunnen moduleren. TMEM119 is ontstaan als een Microglia-specifieke marker over gezondheids-en ziekte omstandigheden22. In combinatie met IBA1, deze marker wordt nuttig voor het differentiëren van deze cellen van infiltreren macrofagen, die TMEM119-negatief en IBA1-positief zijn. Terwijl het is ontwikkelmentaal gereguleerd, TMEM119 wordt uitgedrukt zo vroeg als postnatale dagen 3 (P3) en 6 (P6), gestaag toenemen tot het bereiken van volwassen niveaus tussen P10 en P1422. IBA1 wordt uitgedrukt in embryonale dag 10,5 (E 10.5)23. Het voorgestelde dubbele etiketterings protocol is dus nuttig om deze twee populaties gedurende het hele postnatale leven te bestuderen.
Dit protocol biedt een stapsgewijze immunokleurings procedure die discriminatie tussen Microglia en perifere macrofagen mogelijk maakt. Ook wordt uitgelegd hoe u een kwantitatieve analyse van de microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals analyse van perifere macrofaag infiltratie uitvoeren. Hoewel het onderzoek naar Microglia en perifere macrofagen op zichzelf nuttig is, maakt dit protocol de lokalisatie van neuroinflammatoire Foyers mogelijk. het fungeert dus ook als een platform voor het identificeren van specifieke regio’s om te onderzoeken, met het gebruik van complementaire (nog, meer tijd-en resource-verbruiken) technieken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol kan worden onderverdeeld in twee kritieke onderdelen: kwaliteit van de kleuring en analyse. Als de kleuring niet optimaal is, zal het falen om microglial cellen adequaat weer te geven, waardoor de dichtheid, verdeling en morfologie metingen worden aangetast. Bovendien kan het aandeel van infiltratie perifere myeloïde cellen worden onderschat. Dit is een geoptimaliseerde versie van het kleurings protocol, maar er zijn verschillende factoren die kunnen resulteren in suboptimale afbeeldingen. Hoewel de perfusi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn Nathalie Vernoux dankbaar voor haar begeleiding en assistentie bij de experimenten. Ook willen we drs. Emmanuel Planel en Serge Rivest bedanken voor respectievelijk het gebruik van hun fluorescentie-en confocale microscopen. Dit werk werd deels gefinancierd door beurzen van de Mexicaanse Raad van Wetenschappen en technologie (CONACYT; tot F. G. I), de Fondation famille-Choquette en het Centre thématique de Recherche en neurowetenschappen (CTRN; to K.P.), Fonds de recherche du Québec-Santé (naar M.B.), en Shastri Indo-Canadees Instituut (naar K.B.), evenals een ontdekking subsidie van natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC) aan M.E.T. M.E.T. houdt een Canada Research Chair (Tier II) van neuro-immune plasticiteit in gezondheid en therapie.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
- Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
- Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
- Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
- Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
- Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
- Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
- Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
- Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).
