Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale
Summary
Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.
Abstract
La microscopia intravitale (IVM) è ampiamente utilizzata per monitorare i processi fisiologici e patofisiologici all’interno della cascata di reclutamento di leucociti in vivo. Il protocollo attuale rappresenta un metodo pratico e riproducibile per visualizzare l’interazione con l’endotelio leucocito che porta al reclutamento di leucociti nel tessuto derivato dal muscolo scheletrico all’interno dell’organismo intatto del topo. Il modello è applicabile a tutti i campi di ricerca che si concentrano sull’attivazione dei noulociti e sul loro ruolo nella malattia.
Forniamo un protocollo passo dopo passo per guidare attraverso il metodo e per evidenziare potenziali insidie e difficoltà tecniche. Il protocollo copre i seguenti aspetti: impostazioni sperimentali e materiale richiesto, anestesia del topo, dissezione del muscolo cremaster così come cannulation tracheale e carotide, registrazioni IVM e analisi offline. Formati di dati come leucociti aderenti, flusso di rotolamento (RF) e frazione del flusso di rotolamento (RFF) sono spiegati in dettaglio e vengono discusse le applicazioni appropriate. Risultati rappresentativi da topi mdx carenti distrofina sono forniti nella sezione risultati.
IVM è un potente strumento per valutare il reclutamento di leucociti in un ambiente in vivo; tuttavia, delineare ad esempio la funzione endoteliale e leucocito può richiedere una combinazione con configurazioni ex vivo come esperimenti di camera di flusso. Inoltre, il background genetico degli animali di interesse può influenzare notevolmente il reclutamento di base, richiedendo la messa a punto individuale del protocollo previsto. Nonostante i suoi limiti, IVM può servire come piattaforma per tradurre prontamente i risultati in vitro in un organismo vertebrato vivente.
Introduction
La microscopia intravitale (IVM) è uno strumento comunemente applicato nel campo della biologia del leucocito. Il reclutamento di leukociti segue una cascata di eventi ben definiti iniziati dalla cattura del leucocito, dal rotolamento e dall’adesione al muro endoteliale, e infine dalla trasmigrazione e dall’estramigrazione dei leucociti nel sito effettivo di infiammazione1. Ogni passo è mediato e controllato da varie chemiochine (ad esempio, IL-8/CXCL8), recettori (ad esempio, LFA-1, Mac-1) e molecole di adesione delle cellule endoteliali corrispondenti (ad esempio, ICAM-1, VCAM-1 ed E-Selectin)2,3. L’interazione di diversi siti normativi, fattori di controllo e mediatori della cascata di reclutamento di leucociti come recettore dei prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE), della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1), del motivo C-X-C ligando (CXCL)1/2 e del loro recettore CXCR2 sono stati scoperti utilizzando IVM4,5,6,7,8,9.
Il metodo di IVM è stato descritto per molti organi e tessuti diversi come l’intestino10, pelle11, linfonodi12, il sacco di tuorlo embrionale13 e altri. Tuttavia, il metodo più studiato di IVM è il modello cremaster, descritto per la prima volta nei ratti14. Mentre ancora utilizzato nei ratti15, il metodo è oggi applicato principalmente nei topi a causa dell’alta abbondanza di diverse linee transgeniche. Il nostro gruppo ha recentemente evidenziato il potenziale ruolo del cremaster IVM nel campo delle muscolopatie infiammatorie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) che studiano topi immdxliti carenti di distrofina16. Grazie alla sua sottile composizione in fibra intrecciata e facilmente accessibile, il muscolo cremante rappresenta il muscolo candidato ideale da studiare come intero supporto utilizzando microscopia leggera o fluorescente. Il reclutamento e l’estravlocazione dei leonici avvengono principalmente in venule post-capillari, che possono essere facilmente identificate su uno strato muscolare continuo nel muscolo cremante.
Il vantaggio dell’imaging in vivo rispetto ad altri saggi in vitro è il suo contesto biologico in un organismo vivente. Allo stesso tempo, delineare contributi specifici per le cellule al reclutamento alterato dei leucociti può richiedere ulteriori modelli in vitro come camere di flusso o saggi endoteliali. La combinazione di più metodi produrrà i dati più convincenti. Gli scienziati dovrebbero essere consapevoli dei limiti del modello cremaster in quanto qualsiasi manipolazione chirurgica porterà ad un aumento del traffico e del reclutamento dei leucociti. Di conseguenza, l’assunzione di base è difficile da stimare con questo metodo. Nonostante la sua ampia applicazione, IVM del cremaster può essere impegnativo e una nuova configurazione può richiedere tempo e risorse per stabilire. Ora forniamo un protocollo facile che aiuterà a evitare alcuni degli errori comuni in IVM. Inoltre, le limitazioni saranno discusse e i metodi gratuiti saranno evidenziati ove applicabile.
IVM del cremaster rappresenta un approccio ideale da attuare nel campo degli studi infiammatori e infettivi. Più specificamente, il modello cremaster può essere di grande interesse per gli scienziati che studiano la biologia muscolare scheletrica nel contesto delle malattie infiammatorie.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM come metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare diversi tipi di cellule in diversi organi ed è stato ampiamente descritto e discusso19. L’obiettivo principale di questo studio è quello di fornire un approccio efficiente per impostare ed eseguire IVM nel muscolo cremaster. Praticare il metodo produrrà risultati affidabili e riproducibili. Pertanto, la pianificazione e la standardizzazione sono fattori chiave per padroneggiare la tecnica. Soprattutto, la tecnica dipende molto dai para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell’istruzione e della ricerca (BMBF) 01GL1746E nell’ambito del Consorzio PRIMAL. Gli autori riconoscono Britta Heckmann e Silvia Pezer per un’abile assistenza tecnica.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
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