Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie
Summary
Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.
Abstract
Intravital microscopie (IVM) wordt veel gebruikt om fysiologische en pathofysiologische processen te monitoren binnen de leukocyten rekruteringcascade in vivo. Het huidige protocol vertegenwoordigt een praktische en reproduceerbare methode om de leukocyten endotheelinteractie te visualiseren die leidt tot het rekruteren van skeletspieren in skeletspierafgeleid weefsel in het intacte organisme van de muis. Het model is van toepassing op alle onderzoeksgebieden die zich richten op granulocyteactivering en hun rol bij ziekte.
We bieden een stapsgewijs protocol om de methode te begeleiden en mogelijke valkuilen en technische problemen te benadrukken. Het protocol behandelt de volgende aspecten: experimentele instellingen en vereist materiaal, anesthesie van de muis, dissectie van de cremaster spier evenals tracheale en halsslagader cannulation, IVM opnames en offline analyse. Gegevensformaten zoals aanhangende leukocyten, rolling flux (RF) en rolling flux fraction (RFF) worden in detail uitgelegd en passende toepassingen worden besproken. Representatieve resultaten van dystrofinedeficiënte mdx muizen worden verstrekt in de resultaten sectie.
IVM is een krachtig instrument om de rekrutering van leukocyten in vivo te beoordelen; het afzetten van bijvoorbeeld endotheel- en leukocytenfunctie kan echter een combinatie met ex vivo opstellingen zoals stroomkamerexperimenten vereisen. Bovendien kan de genetische achtergrond van dieren van belang een grote invloed hebben op de aanwerving van basislijnen, waardoor individuele aanpassing van het verstrekte protocol vereist is. Ondanks zijn beperkingen kan IVM dienen als een platform om in vitro bevindingen gemakkelijk te vertalen naar een levend gewerveld organisme.
Introduction
Intravital microscopie (IVM) is een veel toegepast instrument op het gebied van leukocytenbiologie. Leukocyten rekrutering volgt een cascade van goed gedefinieerde gebeurtenissen geïnitieerd door leukocyten vangen, rollen en hechting aan de endotheelwand, en ten slotte transmigratie en extravasatie van leukocyten naar de werkelijke plaats van ontsteking1. Elke stap wordt bemiddeld en gecontroleerd door verschillende chemokines (bijvoorbeeld IL-8/CXCL8), receptoren (bijvoorbeeld LFA-1, Mac-1) en bijbehorende endotheelcelhechtingsmoleculen (bijvoorbeeld ICAM-1, VCAM-1 en E-Selectin)2,3. De interactie van verschillende regelgevende sites, controlerende factoren en bemiddelaars van de leukocyten rekruteringcascade zoals receptor van geavanceerde glycatieeindproducten (RAGE), intercellulaire hechtingsmolecuul 1 (ICAM-1), C-X-C motief ligand (CXCL)1/2 en hun receptor CXCR2 werden ontdekt met behulp van IVM4,5,6,7,8,9.
De methode van IVM is beschreven voor veel verschillende organen en weefsels zoals de darm10, huid11, lymfeklieren12, de embryonale dooier zak13 en anderen. Echter, de meest bestudeerde methode van IVM is de cremaster model, voor het eerst beschreven bij ratten14. Terwijl nog steeds gebruikt bij ratten15, de methode wordt tegenwoordig vooral toegepast in muizen als gevolg van de hoge overvloed aan verschillende transgene lijnen. Onze groep heeft onlangs gewezen op de potentiële rol van cremaster IVM op het gebied van inflammatoire muscolopathies zoals Duchenne Spierdystrofie (DMD) bestuderen dystrophin-deficiënte mdx muizen16. Door zijn dunne verweven en gemakkelijk toegankelijke vezelsamenstelling vertegenwoordigt de cremaster spier de ideale kandidaatspier die als geheel moet worden bestudeerd met behulp van lichte of fluorescerende microscopie. Leukocyte nevenwerving en extravasatie vinden voornamelijk plaats in postcapillaire venules, die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd op een continue spierlaag in de cremaster spier.
Het voordeel van in vivo beeldvorming in vergelijking met andere in vitro testen is de biologische context in een levend organisme. Tegelijkertijd kan het afdekken van celspecifieke bijdragen aan gewijzigde leukocytenwerving aanvullende in vitro modellen vereisen, zoals stroomkamers of endotheliale tests. De combinatie van meerdere methoden levert de meeste overtuigende gegevens op. Wetenschappers moeten zich bewust zijn van de beperkingen van de cremaster model als een chirurgische manipulatie zal leiden tot meer leukocyten handel en werving. Daarom is baseline recruitment moeilijk in te schatten met deze methode. Ondanks de brede toepassing, IVM van de cremaster kan een uitdaging zijn en een nieuwe setup kan tijd en middelen te vestigen. We bieden nu een eenvoudig protocol dat zal helpen om een aantal van de gemeenschappelijke fouten in IVM te voorkomen. Ook zullen beperkingen worden besproken en gratis methoden zullen worden gemarkeerd waar van toepassing.
IVM van de cremaster vertegenwoordigt een ideale aanpak die moet worden toegepast op het gebied van ontstekings- en infectieuze studies. Meer specifiek kan het cremaster-model van groot belang zijn voor wetenschappers die skeletspierbiologie bestuderen in de context van ontstekingsziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM als methode is veel gebruikt om verschillende celtypes in verschillende organen te bestuderen en is uitgebreid beschreven en besproken19. Het belangrijkste doel van deze studie is om een efficiënte aanpak te bieden voor het opzetten en uitvoeren van IVM in de cremaster spier. Het beoefenen van de methode zal betrouwbare en reproduceerbare resultaten opleveren. Planning en standaardisatie zijn dus belangrijke factoren om de techniek onder de knie te krijgen. Bovenal is de techniek zeer afhanke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) 01GL1746E als onderdeel van het PRIMAL Consortium. De auteurs erkennen Britta Heckmann en Silvia Pezer voor bekwame technische bijstand.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
