Лазерная захват микродиссекции мыши эмбрионального хряща и кости для анализа экспрессии генов
Summary
Этот протокол описывает микрорассечение лазерного захвата для изоляции хряща и кости от свежезамороженных секций эмбриона мыши. Хрящ и кости могут быть быстро визуализированы кресилфиолетовым окрашиванием и собраны именно для получения высококачественной РНК для транскриптомического анализа.
Abstract
Лазерный захват микродиссекции (LCM) является мощным инструментом для изоляции конкретных типов клеток или областей, представляющих интерес от неоднородных тканей. Клеточная и молекулярная сложность скелетных элементов возрастает с развитием. Неоднородность тканей, например, на стыке хрящевых и косых элементов друг с другом или с окружающими тканями, является одним из препятствий для изучения развития хряща и костей. Наш протокол обеспечивает быстрый метод обработки тканей и изоляции хряща и кости, что дает высокое качество РНК для анализа экспрессии генов. Свежие замороженные ткани эмбрионов мыши разделены и краткое кресиловое фиолетовое окрашивание используется для визуализации хряща и кости с цветами, отличными от окружающих тканей. Слайды затем быстро обезвоживаются, и хрящи и кости изолированы впоследствии LCM. Минимизация воздействия вавных растворов в ходе этого процесса поддерживает целостность РНК. Хрящ мыши Мекеля и мандибулярная кость на E16.5 были успешно собраны, а анализ экспрессии генов показал дифференциальное выражение генов маркеров остеобластов, остеоцитов, остеокластов и хондроцитов. Высокое качество РНК также было выделено из целого ряда тканей и эмбрионального возраста. Этот протокол детали образца подготовки для LCM в том числе криоэмбеддинг, секции, окрашивания и обезвоживания свежих замороженных тканей, а также точной изоляции хряща и кости LCM в результате чего высокое качество РНК для транскриптомического анализа.
Introduction
Опорно-крестеская система представляет собой многокомпонентную систему, состоящую из мышц, соединительной ткани, сухожилия, связок, хряща и кости, иннерватизованной нервами и васкуляризованной кровеносными сосудами1. Скелетные ткани развиваются с возрастающей клеточной неоднородностью и структурной сложностью. Хрящ и кости развиваются из той же линии остеохондропрогенитора и тесно связаны между собой. Эмбриональный хрящ и кости развиваются в сочетании с мышцами, нервами, кровеносными сосудами и недифференцированным мезенхимом. Хрящ также может быть окружен кости, такие как хрящ Мекель и кондилярный хрящ в челюстно-прилежной кости. Эти ткани анатомически связаны и взаимодействуют друг с другом через внеклеточные сигналы во время развития. При изучении экспрессии генов при развитии хряща и костей одним из препятствий является неоднородность скелетных структур, состоящих из нескольких типов тканей. Точная изоляция конкретной ткани интереса является ключом к успешному транскрипционного анализа.
Лазерный захват микродиссекции (LCM) является мощным инструментом для изоляции типов клеток или регионов, представляющих интерес в неоднородных тканях, и воспроизводимый и чувствителен к одноклеточному уровню2. Он может точно цели и захвата клеток, представляющих интерес для широкого спектра вниз по течению анализы в транскриптомике, геномике и протеомике3,4. Качество изолированной РНК, ДНК или белка можно оценить с помощью биоанализа или эквивалентной платформы. Например, качество РНК указывается номером целостности РНК (RIN)5.
Здесь мы предоставляем протокол для быстрого окрашивания и изоляции хряща и кости LCM от свежих замороженных тканей. Мы используем эмбрион мыши, чтобы продемонстрировать, что этот протокол дает высококачественную РНК для последующего транскриптомического анализа, такого как секвенирование РНК (РНК-сек).
Protocol
Representative Results
Discussion
LCM позволяет обезолюрить обогащенные или однородные популяции клеток от неоднородных тканей. Его преимущества включают быстрый и точный захват клеток в контексте in vivo, в то время как потенциальные недостатки включают в себя его время, дорого, и ограничивается необходимостью для п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом стоматологических и краниофациальных исследований (R01DE022988) и Национальным институтом здоровья детей и развития человека (P01HD078233) и Национальным институтом здоровья детей и развития человека (P01HD07823). Авторы благодарят Biorepository и патологии Core для доступа к Leica LMD 6500 платформы в Icahn школы медицины на горе Синай.
Materials
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O’Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -. M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used?. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
