Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica
Summary
Este protocolo descreve a microdissecção da captação do laser para a isolação da cartilagem e do osso das seções congeladas frescas do embrião do rato. Cartilagem e osso podem ser rapidamente visualizados por manchas violetas cresyl e coletados precisamente para produzir RNA de alta qualidade para análise transcriptômica.
Abstract
A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos específicos de células ou regiões de interesse de tecidos heterogêneos. A complexidade celular e molecular de elementos esqueléticos aumenta com o desenvolvimento. A heterogeneidade tecidual, como na interface de elementos cartilaginosos e osseos uns com os outros ou com tecidos circundantes, é um obstáculo para o estudo do desenvolvimento de cartilagem e osso. Nosso protocolo fornece um método rápido de processamento de tecidos e isolamento de cartilagem e osso que produz RNA de alta qualidade para análise de expressão gênica. Os tecidos congelados frescos de embriões do rato são seccionados e a mancha violeta breve do cresyl é usada para visualizar a cartilagem e o osso com as cores distintas dos tecidos circunvizinhos. Slides são então rapidamente desidratados, e cartilagem e osso são isolados posteriormente por LCM. A minimização da exposição a soluções aquosas durante este processo mantém a integridade do RNA. A cartilagem e osso mandibular do rato Meckel na E16.5 foram coletados com sucesso e a análise da expressão gênica mostrou expressão diferencial de genes marcadores para osteoblastos, osteócitos, osteoclastos e condrocitos. O RNA de alta qualidade também foi isolado de uma variedade de tecidos e idades embrionárias. Este protocolo detalha a preparação da amostra para LCM que inclui o cryoembedding, seção, coloração e desidratação de tecidos congelados frescos, e a isolação precisa da cartilagem e do osso por LCM tendo por resultado o RNA de alta qualidade para a análise transcriptomic.
Introduction
O sistema musculoesquelético é um sistema multicomponente composto de músculo, tecido conjuntivo, tendão, ligamento, cartilagem e osso, interno e vascularizado pelos vasos sanguíneos1. Os tecidos esqueléticos desenvolvem-se com o aumento da heterogeneidade celular e complexidade estrutural. Cartilagem e osso se desenvolvem a partir da mesma linhagem osteochondroprogenitor e são altamente relacionados. Cartilagem embrionária e osso se desenvolvem em associação com músculos, nervos, vasos sanguíneos e mesenchyme indiferenciado. A cartilagem também pode ser cercada por ossos, como a cartilagem de Meckel e cartilagem condylar dentro do osso mandibular. Estes tecidos são anatomicamente associados e interagem uns com os outros através de sinais extracelulares durante o desenvolvimento. No estudo da expressão gênica no desenvolvimento de cartilagem e osso, um obstáculo é a heterogeneidade de estruturas esqueléticas compostas por múltiplos tipos de tecido. O isolamento preciso do tecido específico de interesse é fundamental para uma análise transcricional bem-sucedida.
A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos de células ou regiões de interesse dentro de tecidos heterogêneos, e é reproduzível e é sensível ao nível de célula única2. Ele pode precisamente alvo e capturar células de interesse para uma ampla gama de ensaios a jusante em transcriptômica, genômica e proteômica3,4. A qualidade do RNA, DNA ou proteína isolado pode ser avaliada com um bioanalisador ou plataforma equivalente. Por exemplo, a qualidade do RNA é indicada pelo número de integridade do RNA (RIN)5.
Aqui, nós fornecemos um protocolo para a coloração rápida e isolamento da cartilagem e osso por LCM de tecidos congelados frescos. Usamos o embrião do camundongo para demonstrar que este protocolo produz RNA de alta qualidade para análise transcriptômica subsequente, como sequenciamento de RNA (RNA-seq).
Protocol
Representative Results
Discussion
O LCM permite o isolamento de populações de células enriquecidas ou homogêneas de tecidos heterogêneos. Suas vantagens incluem a captura rápida e precisa de células em seu contexto in vivo, enquanto as desvantagens potenciais incluem que seja demorado, caro e limitado pela necessidade de o usuário reconhecer subpopulações distintas dentro de uma amostra especificada30. Este protocolo fornece detalhes de LCM da cartilagem embrionária do rato e do osso, destacando o uso da mancha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (R01DE022988) e pelo Instituto Nacional eunice Kennedy Shriver de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (P01HD078233). Os autores agradecem ao Núcleo de Biorepositório e Patologia pelo acesso à plataforma Leica LMD 6500 na Escola de Medicina Icahn, no Monte Sinai.
Materials
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
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