לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים
Summary
פרוטוקול זה מתאר מיקרוניתוח לכידת לייזר עבור הבידוד של סחוס ועצם מחלקים קפואים טריים של העובר העכבר. סחוס ועצם יכול להיות דמיינו במהירות על ידי cresyl סגול כתמים ונאסף בדיוק כדי להניב RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח transcript.
Abstract
לכידת לייזר (LCM) היא כלי רב עוצמה לבידוד סוגי תאים ספציפיים או אזורים מעניינים מרקמות הטרוגניות. המורכבות התאית והמולקולרית של יסודות השלד גדלה בפיתוח. טרוגניות רקמות, כגון בממשק של הסחוס ואלמנטים osseous אחד עם השני או עם הרקמות הסובבות, הוא אחד מכשול למחקר של פיתוח סחוס ועצם. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה מהירה של עיבוד רקמות ובידוד של סחוס ועצם התשואות באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח ביטוי גנים. הרקמות הקפואות טרי של עוברי העכבר הם מנות ומכתים קצר cresyl סגול משמש להמחיש סחוס ועצם עם צבעים נפרדים מרקמות המקיפים. השקופיות מיובשות אז במהירות, והסחוס והעצמות מבודדים לאחר מכן על ידי LCM. מזעור החשיפה לפתרונות מימית במהלך תהליך זה שומר על שלמות RNA. הסחוס ועצם הלסת של העכבר על E 16.5 היו נאספים בהצלחה וניתוח ביטוי גנטי הראה ביטוי דיפרנציאלי של גנים סמן עבור אוסטאופתי, אוסטאופציטים, אוסטאופםנמשך, ו כונדרוציטים. באיכות גבוהה RNA היה גם מבודד מתוך מגוון של רקמות וגילאים עובריים. פרוטוקול זה הכנה לדוגמה של LCM כולל קריוהטבעה, הפחתה, כתמים והסרת לחות של רקמות קפואות טריות, ובידוד מדויק של סחוס ועצם על ידי LCM וכתוצאה מכך באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח transcript.
Introduction
מערכת השלד והשרירים היא מערכת מרובת רכיבים המורכבת שריר, רקמת חיבור, גיד, רצועה, סחוס, ועצם, innervated על ידי עצבים ובאמצעות כלי דם1. רקמות השלד להתפתח עם הגדלת טרוגניות הסלולר והמורכבות המבנית. סחוס ועצם להתפתח מאותו השושלת האוסטכונדרוקדמון, הם קשורים מאוד. הסחוס ועצם עובריים להתפתח בשיתוף עם השרירים, העצבים, כלי הדם, מובחן mesenchyme. הסחוס עשוי גם להיות מוקף עצם, כגון הסחוס של מקל הסחוס condylar בתוך עצם הלסת. רקמות אלה משויכים מבחינה אנטומית ומתקשרים אחד עם השני באמצעות אותות משוונים במהלך הפיתוח. במחקר של ביטוי גנים בהתפתחות של סחוס ועצם, מכשול אחד הוא הטרוגניות של מבנים השלד מורכב מסוגים מרובים של רקמות. בידוד מדויק של רקמת העניין הספציפית הוא המפתח לניתוח מוצלח של הטרנססקריפט.
לכידת לייזר (LCM) הוא כלי רב עוצמה כדי לבודד את סוגי התאים או אזורים המעניינים בתוך רקמות הטרוגניות, והוא הינו רגיש לרמה תא בודדת2. זה יכול בדיוק למקד וללכוד את התאים של עניין עבור מגוון רחב של במורד הזרם בחני אמר ב transcript, גנומיקה, ו פרוטאומניקס3,4. האיכות של ה-RNA המבודד, ה-DNA או החלבון יכול להיות מוערך עם הפלטפורמה bioanalyzer או שווה ערך. לדוגמה, איכות ה-RNA מצוינת על-ידי מספר התקינות של RNA (RIN)5.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול לצביעת ובידוד מהירה של סחוס ועצם על ידי LCM מרקמות קפואות טריות. אנו משתמשים העובר העכבר כדי להדגים כי פרוטוקול זה תשואות באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח הטרנססקריפט הבאים, כגון רצפי RNA (RNA-seq).
Protocol
Representative Results
Discussion
LCM מאפשרת בידוד של אוכלוסיות תאים מועשר או הומוגניים מרקמות הטרוגניות. היתרונות שלה כוללים לכידת מהירה ומדויקת של תאים בהקשר vivo שלהם, בעוד חסרונות פוטנציאליים כוללים אותו להיות זמן רב, יקר, ומוגבל על ידי הצורך המשתמש לזהות אוכלוסיות משנה נפרדות בתוך דוגמה מסוימת30. פרוטוק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לרפואת שיניים ומחקר קרניו Ofacial (R01DE022988) ו שרייבר יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (P01HD078233). המחברים מודים למרכז הרפואי והפתולוגיה לגישה לפלטפורמת לייקה LMD 6500 בבית הספר Icahn לרפואה בהר סיני.
Materials
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O’Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -. M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used?. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
