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Developmental Biology

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Published: December 18, 2019
doi:
10.3791/60503
, , , ,
1Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology,Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Dieses Protokoll beschreibt lasercapture microdissection for the isolation of knorpel and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Knorpel und Knochen können durch Kresylviolettfärbung schnell visualisiert und präzise gesammelt werden, um hochwertige RNA für die transkriptomische Analyse zu liefern.

Abstract

Laser capture microdissection (LCM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um bestimmte Zelltypen oder Interessengebiete von heterogenen Geweben zu isolieren. Die zelluläre und molekulare Komplexität von Skelettelementen nimmt mit der Entwicklung zu. Gewebeheterogenität, wie z.B. an der Schnittstelle von knorpeligen und ossösen Elementen untereinander oder mit umgebenden Geweben, ist ein Hindernis für die Untersuchung der Entwicklung von Knorpel und Knochen. Unser Protokoll bietet eine schnelle Methode der Gewebeverarbeitung und Isolierung von Knorpel und Knochen, die eine qualitativ hochwertige RNA für die Genexpressionsanalyse liefert. Frische gefrorene Gewebe von Mausembryonen werden geschnitten und kurze kresylviolette Färbung wird verwendet, um Knorpel und Knochen mit Farben zu visualisieren, die sich von umgebenden Geweben unterscheiden. Die Rutschen werden dann schnell dehydriert, Knorpel und Knochen werden anschließend von LCM isoliert. Die Minimierung der Exposition gegenüber wässrigen Lösungen während dieses Prozesses bewahrt die RNA-Integrität. Maus Meckels Knorpel und Unterkieferknochen bei E16.5 wurden erfolgreich gesammelt und die Genexpressionsanalyse zeigte die differenzielle Expression von Markergenen für Osteoblasten, Osteozyten, Osteoklasten und Chondrozyten. Hochwertige RNA wurde auch aus einer Reihe von Geweben und embryonalen Zeitaltern isoliert. Dieses Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung für LCM, einschließlich Kryoembedding, Schnitt, Färbung und Dehydrierung von frischem gefrorenem Gewebe, und eine präzise Isolierung von Knorpel und Knochen durch LCM, was zu einer qualitativ hochwertigen RNA für die transkriptomische Analyse führt.

Introduction

Das Muskel-Skelett-System ist ein Mehrkomponentensystem, bestehend aus Muskel, Bindegewebe, Sehne, Band, Knorpel und Knochen, innerviert durch Nerven und durch Blutgefäße vaskularisiert1. Das Skelettgewebe entwickelt sich mit zunehmender zellulärer Heterogenität und struktureller Komplexität. Knorpel und Knochen entwickeln sich aus der gleichen Osteochondroprogenitor-Linie und sind stark verwandt. Embryonaler Knorpel und Knochen entwickeln sich in Verbindung mit Muskeln, Nerven, Blutgefäßen und undifferenziertem Mesenchym. Knorpel kann auch von Knochen umgeben sein, wie Meckels Knorpel und Kondylarknorpel innerhalb des Unterkieferknochens. Diese Gewebe sind anatomisch assoziiert und interagieren während der Entwicklung durch extrazelluläre Signale miteinander. Bei der Untersuchung der Genexpression bei der Entwicklung von Knorpel und Knochen ist ein Hindernis die Heterogenität von Skelettstrukturen, die aus mehreren Gewebetypen bestehen. Eine präzise Isolierung des spezifischen Gewebes von Interesse ist der Schlüssel für eine erfolgreiche Transkriptionsanalyse.

Lasercapture Microdissection (LCM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Zelltypen oder Relevante Regionen innerhalb heterogener Gewebe zu isolieren, ist reproduzierbar und empfindlich gegenüber der Einzelzellebene2. Es kann Zellen von Interesse für eine breite Palette von nachgelagerten Assays in Transkriptomik, Genomik und Proteomik präzise zielen und erfassen3,4. Die Qualität der isolierten RNA, DNA oder Protein kann mit einem Bioanalysator oder einer gleichwertigen Plattform beurteilt werden. Beispielsweise wird die RNA-Qualität durch die RNA-Integritätsnummer (RIN)5angezeigt.

Hier bieten wir ein Protokoll zur schnellen Färbung und Isolierung von Knorpel und Knochen durch LCM aus frisch gefrorenem Gewebe. Wir verwenden den Mausembryon, um zu zeigen, dass dieses Protokoll qualitativ hochwertige RNA für nachfolgende transkriptomische Analysen liefert, wie z. B. RNA-Sequenzierung (RNA-Seq).

Protocol

Gewebe von Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals gewonnen, und Studienprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai genehmigt. 1. Zubereitung von Frischgefrorenen Exemplaren Sezieren Sie den Embryo oder das Gewebe von Interesse. Einbetten der Probe in eine Einweg-Einbettform mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung. Passen Sie d…

Representative Results

Koronale Abschnitte von frisch gefrorenem Mausgewebe bei E16.5 wurden verwendet, um die Isolierung und Sammlung von Meckels Knorpel (MC), Kondylarknorpel und Unterkieferknochen durch LCM zu demonstrieren. Mausembryonen bei E16.5 wurden seziert und in kryogene Formen mit OCT-Verbindung eingebettet. Proben in Formen wurden schnell in einem Trockeneis- und Methyl-2-Butanbad eingefroren und bei -80 °C gelagert. Um die kresylviolette Färbung von Knorpel und Knochen zu demonstrieren, wurde eine Kr…

Discussion

LCM ermöglicht die Isolierung angereicherter oder homogener Zellpopulationen aus heterogenen Geweben. Zu seinen Vorteilen gehört die schnelle und präzise Erfassung von Zellen in ihrem In-vivo-Kontext, während mögliche Nachteile darin bestehen, dass sie zeitaufwändig, teuer und durch die Notwendigkeit begrenzt ist, dass der Benutzer unterschiedliche Subpopulationen innerhalb einer bestimmten Stichprobe30erkennt. Dieses Protokoll enthält Details zu LCM von embryonalem Knorpel und Kno…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) und dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233) unterstützt. Die Autoren danken dem Biorepository und Pathologie-Kern für den Zugang zur Leica LMD 6500 Plattform an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai.

Materials

2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736
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References

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Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).
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