マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

この報告書の目的は、KPC由来PDA細胞株の超音波誘導移植を行うための詳細なプロトコルを提供することにあった。図2-4に示す代表的な実験では、UG-OTIM腫瘍が一貫した速度で、用量依存的に増殖することを確認した。さらに、UG-OTIM腫瘍がKPC TMEの顕著な免疫学的および組織学的特徴を再現することを示す。従って、UG-OTIMシステムは、生体内で新しい治療の組み合わせを迅速にスクリーニングするために高スループットの方法で使用することができる前臨床PDAマウスモデルである。 ここで概説したUG-OTIMプロトコルを用いて、マウスを移植用に調製し、加熱された超音波プラットフォームに固定し、プラットフォームとトランスデューサの両方の位置を、図1Aに示すようにこの手順に合わせて調整した。高解像度超音波イメージングは、腎臓または脾臓の穿極なしに標的とすることができるマウス膵臓内の注射部位を同定するために使用された(図1B)。超音波可視化の下で、針は腹膜壁を通して腹腔に慎重に導入され、マウス膵臓に導かれました(図1C)。針の正しい配置が確立された後、腫瘍細胞懸濁液を非常にゆっくりと膵臓に注入した。膵臓内の気泡の存在によって移植が成功したことが確認された(図1D)。初期の実験では、マウスを犠牲にし、膵臓の総体組織中の流体ボーラスを直接可視化して処置の有効性を検証した(図1E)。 腫瘍移植および増殖速度は、毎週の超音波イメージングによって監視された。移植に成功した腫瘍は、実験の時間を通して膵臓の境界内に含まれていた腫瘍を産生した(図2A)。超音波ソフトウェア(図2C)は、各時点で腫瘍領域と体積を決定するために使用される、ならびに生成される測定された腫瘍の3Dマッピングのために使用される(図2B)、および3D画像がマウスのネクロプシーの時点で確認された(図2C)。UG-OTIM処置中の不適切な細胞注射は、腹壁腫瘍の発症をもたらす可能性がある(図2Dに示されている代表的な画像)。腹腹腫瘍を有するマウスは、さらなる研究から除外することができる。 前臨床試験での使用に最適な細胞濃度を決定するために、C57Bl/6 KPC由来PDA細胞株(4662)9を6つの独立した実験にわたって素朴な野生型C57Bl/6マウスに注入した。この細胞株(インビトロで6回通過)は、完全に裏十字型KPC腫瘍軸受マウス(>10世代、SNP解析19により確認された)に由来し、分子細胞適合複合体不一致腫瘍拒絶抗原を防止した。腫瘍細胞を低いチッタ(1.25 x 106細胞/25μL)および高いチッター(5 x 106細胞/25μL)用量で注射した。高いタター腫瘍注射は、低いタイヤーコホートと比較して注射の3週間後に腫瘍を有する動物のより大きな割合をもたらした(図3A)。腫瘍発症の遅延にもかかわらず、全体的な腫瘍増殖速度は2回の用量間で有意に異なっていなかった(図3B)。同様に、2つのコホート間の生存率は有意に異なっていなかったが、低力子コホートにおける生存率がわずかに改善されるデータ傾向(図3C)。高い観度コホートはまた、低いチッターコホートよりも4週間の後注射によって前臨床研究に登録可能な腫瘍を有するマウスのより大きな割合を産生した(図3D)。高いおよび低いタイヤーコホートの両方からのマウスの大半は、25日目までに登録可能な腫瘍を提示し、腹水を含む末期疾患症状を発症した(データは示されていない)。転移は、このプロトコルからの細胞用量で4662を使用して起こらないが、異なる細胞株または用量33でモデル化され得る。 UG-OTIM法は、私たちの初期の実験で困難だった所望の注射部位を正確に局在させるために、細かい運動能力の習得を必要としました。このため、膵臓内で腫瘍を発症した動物の数(移植成功)を、超音波誘導腫瘍移植を受けた動物の総数と比較した表を含めた(表1)。動物は、腫瘍が望ましくない場所(すなわち、腎臓)で発達した場合、または示されているように、注射後6週間までに腫瘍の証拠がなかった場合、将来の分析から排除された。各実験からの登録可能な膵腫瘍(≥20mm3腫瘍容積)を有するマウスの割合の毎週の進行を表1に示す。 従来の外科的オルソトピックモデルではなくUG-OTIMアプローチを使用する利点があるかどうかを判断するために(技術に熟達した後の時間投資を超えて)、各処置後のマウスの腹壁におけるPDA腫瘍の播種を比較した。2/31マウス(6.5%)UG-OTIM注射後に意図しない腹壁腫瘍を発症し、外科的注射後に腹壁腫瘍を発症した7/15マウスと比較した(46.6%, p< 0.0029) (表1)。従って、腹腹隔における追加の腫瘍の播種速度は、外科的移植と比較してUG-OTIM法において大幅に減少する。 UG-OTIM腫瘍を有するマウスを犠牲にした結果、腫瘍の総解剖学は自発的なKPC腫瘍に類似していることがわかった(図4A)。組織学的解析は、両方のモデルで類似した異常な管構造のパターンを実証し、ヒト疾患の形態を再現した(図4B)。KPCおよびUG-OTIM腫瘍の両方における免疫浸潤を調べるために、代表的な組織学的サンプルをCD3(T細胞で表す)およびF4/80(マクロファージで表される)に染色した。どちらのモデルでも、染色パターンはT細胞に浸透しにくい腫瘍を明らかにした(図4C)がマクロファージによって高く浸潤した(図4D)。この知見は、ほとんどのヒトおよびKPC PDAサンプル5、7、12の免疫学的に冷たい表現型と一致する。 図1:マウス膵臓へのPDA細胞の超音波誘導移植(A)腹部器官の高解像度画像を得るために用いられるマウス、超音波段階、超音波プローブの向き。ステージとプラットフォームは、マウス腹部の左上の象限に簡単にアクセスできるように、標準方向から90°回転しています。(B)腎臓、脾臓および膵臓の同定を表す超音波画像。ここで注射針はマウス腹部に対して配置される。(C)マウス膵臓内の針を描いた超音波画像。(D)膵臓への腫瘍細胞の制御注射後の注射部位(青色で概説)における気泡を示す超音波画像。(E)超音波誘導注射後に膵臓にPDA細胞を含む流体ボーラスを明らかにする開腹術。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:UG-OTIM注射後の腫瘍増殖のモニタリング(A)示されているように、2、3、および5週間の注射後におけるUG-OTIM腫瘍(青色で概説)の代表的な超音波画像。(B)代表的な超音波ソフトウェアを用いて5週間後のUG-OTIM腫瘍の3D画像を再構築した。(C)UG-OTIM腫瘍の代表的な総解剖学は、マウス壊死時の5週間後注射後である。(D)7週間後の不適切な細胞注射後に皮下層に増殖する腹膜壁腫瘍の代表的な超音波画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:PDA細胞の超音波誘導注射後の登録可能な腫瘍の用量依存性発症。(A)高いチッター(500,000細胞/25μL)または低チッター(125,000細胞/25μL)腫瘍細胞を有する図1に記載されているように、注射後に示された時点での腫瘍耐性マウスの割合は、示すように。(B)(A)からマウスの腫瘍増殖動態は、各記号がマウスの群を表し、誤差棒は、注射後に示された時点で生きている(A)から生きているマウスのSEM.(C)を示す。マウスは、腫瘍が>1000mm3であったり、腫瘍の併用のために身体の状態が悪かった場合に安楽死または検閲された。(D) (A) からマウスの腫瘍発症を登録する時間 。登録可能な腫瘍は体積で≥20mm3であると考えられている。n=8-20マウス/実験を用いた4つの独立した実験を代表するデータ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 実験 膵腫瘍軸受/総注射 第1週(登録可能) 第2週(登録可能) 第3週(登録可能) 第4週(登録可能) 播種腹腹腫瘍 ハイ・ティター 24/31 Nd 8/24 (3/24) 15/24 (7/24) 23/23 (20/23) 2/20 ロー・ティター 11/17 Nd 3/11 (0/11) 6/11 (3/11) 9/11 (5/11) 0/11 外科注射 15/17 Nd Nd 15/15 (9/15) 15/15 (14/15) 7/15 表1:手術用移植と比較したUG-OTIM腫瘍の成功数高力または低力度当たりの2〜4個の独立した実験と、実験あたりn=5〜10マウスを組み合わせたデータ。「外科的注射」は、125,000個の腫瘍細胞の腹部腹腔鏡手術注射を受けたマウスを示す。「腫瘍軸受」は、膵腫瘍を有するマウスを示す。「登録可能」は、腫瘍体積>20mm3を有する各時点における腫瘍耐性マウスの割合を示す。「播種腹膜腫瘍」は、腫瘍細胞注射から腹膜壁に腫瘍の併用播種を有していた腫瘍を有する腫瘍を有するマウスの総割合を示す。膵臓以外の組織に誤って提示された腫瘍を有するマウス(すなわち、腎臓)は、「腫瘍を有する」集団から除外された(ただし、全注入マウスに含まれる)。NDは、決定されていない。高い層と低いタター群を比較する腹壁の播種の頻度は、外科的移植と比較し、p < 0.0029マンホイットニー後試験による2テールT試験を介して。 図4:UG-OTIM腫瘍はKPC腫瘍微小環境を再現する。代表的な画像が表示されます。一番上の行、KPC腫瘍。下段、5週間後のUG-OTIM腫瘍。(A)壊死時に発興奮した腫瘍の総解剖学。(B)H&E (10X, bar=100μm) (C) CD3 (茶色) (10X, bar=100μm) のための免疫ヒストケミストリー染色。(D)F4/80(赤)およびDAPI(青)の免疫蛍光染色(4X、bar=500μm)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。