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Cancer Research

Ultraschallgeführte orthotopische Implantation von murine Pankreas-Ductalsocarcinom

Published: November 19, 2019
doi:
10.3791/60497
, , , ,
1Department of Medicine, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Pancreatic Cancer Mouse Hospital, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 3Abramson Cancer Center, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 4Parker Institute for Cancer Immunotherapy, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll für die ultraschallgeführte Implantation von murinabgeleiteten duktodrischen Adenokarzinom-Zelllinien direkt in die native Tumorstelle. Dieser Ansatz führte zu Pankreastumoren, die durch Ultraschall-Scanning innerhalb von 2-4 Wochen nach der Injektion nachweisbar waren, und reduzierte den Anteil der Tumorzellsaatierung an der Peritonealwand im Vergleich zur chirurgischen orthotopischen Implantation signifikant.

Abstract

Der jüngste Erfolg der Immun-Checkpoint-Blockade bei Melanom endenokarzinom hat das Feld der Immunonkologie beflügelt und die Grenzen der aktuellen Behandlungen aufgedeckt, da die Mehrheit der Patienten nicht auf Immuntherapie ansprechen. Die Entwicklung präziser präklinischer Modelle zur schnellen Identifizierung neuartiger und wirksamer therapeutischer Kombinationen ist entscheidend, um diesem unerfüllten klinischen Bedarf gerecht zu werden. Pankreas-Duktodas-Adenokarzinom (PDA) ist ein kanonisches Beispiel für einen immunpunktsicheren blockaderesistenten Tumor, bei dem nur 2% der Patienten auf Eine Immuntherapie ansprechen. Die gentechnisch veränderten KrasG12D+/-; Trp53R172H+/-; Das Mausmodell Pdx-1 Cre (KPC) von PDA rekapituliert menschliche Krankheiten und ist ein wertvolles Werkzeug zur Beurteilung von Therapien zur Immuntherapie, die im präklinischen Umfeld resistent sind, aber die Zeit bis zum Tumorbeginn ist sehr variabel. Chirurgische orthotopische Tumorimplantationsmodelle von PDA erhalten die immunbiologischen Kennzeichen der KPC-gewebespezifischen Tumormikroumgebung (TME), erfordern aber ein zeitintensives Verfahren und führen zu einer abnormen Entzündung ein. Hier verwenden wir ein ultraschallgeführtes orthotopisches Tumorimplantationsmodell (UG-OTIM), um KPC-abgeleitete PDA-Zelllinien nicht-invasiv direkt in die Mausbauchspeicheldrüse zu injizieren. UG-OTIM-Tumoren wachsen in der endogenen Gewebestelle, rekapitulieren originalgetreu histologische Merkmale des PDA-TME und erreichen einschreibungsgroße Tumoren für präklinische Studien um vier Wochen nach der Injektion mit minimaler Aussaat an der Peritonealwand. Das hier beschriebene UG-OTIM-System ist ein schnelles und reproduzierbares Tumormodell, das eine Analyse neuartiger therapeutischer Kombinationen im murinen PDA-TME ermöglichen kann.

Introduction

Pankreas-Duktodas-Adenokarzinom (PDA) ist eine notorisch aggressive Erkrankung, die für aktuelle Behandlungen refraktär ist, mit einer trostlosen 5-Jahres-Überlebensrate von 9%1. PDA übertraf vor kurzem Brustkrebs und wurde die dritthäufigste Ursache der krebsbedingten Sterblichkeit in den USA und wird voraussichtlich die zweithäufigste Ursache (hinter nur Lungenkrebs) bis zum Jahr 20302werden. Eine Reihe von Merkmalen, die für die immunologisch “kalte” PDA-Tumor-Mikroumgebung (TME) charakteristisch sind – einschließlich hoher Infiltration immunsuppressiver myeloischer Zellpopulationen3,4,5,6,7, dichte stromale Ablagerung8,9,10,11, und ein Mangel an T-Zellen5,12,13– tragen dazu bei das Scheitern von Immuntherapien in PDA14. Zu diesem Zweck ist die Verwendung eines klinisch relevanten Tiermodells ein wesentliches Instrument zur Untersuchung der Wirksamkeit neuartiger Arzneimittelkombinationen bei immunologisch kalten Tumoren in vivo.

Die gentechnisch veränderten KrasG12D+/-; Trp53R172H+/-; Pdx-1 Cre (KPC) Mausmodell von PDA rekapituliert getreu wichtige klinische Aspekte des menschlichen PDA, einschließlich der molekularen Treiber von Krankheiten und histopathologischen Merkmalen15. KPC-Tumoren entwickeln sich spontan bei vollständig immunkompetenten Mäusen, die das Verhören von therapeutischen Ansätzen einschließlich Chemotherapie16,17, Immuntherapie18,19,20,21und Stroma-Targeting-Therapie9,11,22invivo vor der Verabreichung dieser Medikamente in der klinischen Studie ermöglichen. Trotz seiner vielen Stärken als präklinisches Modell von PDA wird der Einsatz von KPC-Mäusen durch das sehr variable Fortschreiten der spontanen Tumorentwicklung benachteiligt, da der Tumorbeginn zwischen 4 und 40 Wochen liegen kann (und somit die Erhaltung einer großen Brutkolonie erfordert)15. Darüber hinaus haben KPC-Mäuse das Potenzial für polyklonale Primärtumoren23, und es gibt einen rapiden Rückgang der Tiergesundheit und eine Zunahme der Komorbiditäten einschließlich Kachexie und Aszites im Verlauf der Krankheit15.

Eine Alternative zum spontanen KPC-Mausmodell ist die Verwendung eines orthotopischen Implantationsmodells von PDA24. Die direkte chirurgische Implantation von Tumorzelllinien in die native Gewebestelle ist eine kostengünstigere und vorhersehbarere Methode zur Rekapitulation der gewebespezifischen Tumormikroumgebung (TME) von PDA. Die Tumorimplantation ermöglicht die Injektion von klonalen Tumorzelllinien an genetisch gekreuzte Mäuse5, was es Für Wirtsmäuse mit zusätzlichen genetischen Manipulationen ermöglicht, die zeitaufwändig wären, um sich in das KPC-Mausmodell einzureihen. Jedoch, Pankreastumor Implantation erfordert eine arbeitsintensive chirurgische Eingriff, der aberrante Entzündung an der Nahtstelle in der Bauchwandführt 24,25,26, und oft beinhaltet eine lange postoperative Genesung27,28,29.

Technologische Fortschritte in der Ultraschall-Bildgebung mit Nagetier-spezifischen Wandlern liefern hochauflösende Bilder in Echtzeit. Geführt durch die Ultraschall-Bildgebung der Injektionsnadelbewegung in der Peritonealhöhle, kann man gezielt Tumorzellen in die Bauchspeicheldrüse implantieren und dabei die Vorteile orthotopischer Tumorinjektionen in Abwesenheit einer chirurgischen Implantation und damit verbundener Entzündungen nutzen. Dieser Ansatz, als Ultraschall-geführtes orthotopisches Tumorimplantationsmodell (UG-OTIM) bezeichnet, wurde bereits in einem Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs30 sowie in mehreren anderen Krebsmodellen wie Ewings Sarkom, Neuroblastom und Blasenkrebs31,32etabliert.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Durchführung von Ultraschall-geführten Injektionen von Tumorzelllinien in die murine Bauchspeicheldrüse zur Verfügung. Wir zeigen, dass die resultierenden Tumoren die histologischen und immunologischen Merkmale des KPC TME rekapitulieren und daher zur Untersuchung neuartiger therapeutischer Kombinationen, einschließlich Immuntherapien, verwendet werden können, um schnell die vielversprechendsten Behandlungen zu zeigen, die in klinischen Studien weiterzuleiten.

Protocol

Tierprotokolle wurden vom Institutional of Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania überprüft und genehmigt. Weibliche 5- bis 6-wöchige C57Bl/6-Mäuse wurden gekauft (siehe Materialtabelle) und nach 1-3 Wochen Ruhe verwendet. Das University Laboratory Animal Resources überwachte die Tierpflege. 1. Herstellung von PDA-Tumorzelllinien zur Injektion KPC-abgeleitete PDA-Zelllinie in Tumorzellmedien (TC): Dulbeccoes Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt durch 10% Fetal es Bovine Serum (FBS), 2mM L-Glutamin und 83 g/ml Gentamicin. Lassen Sie Zellen in Kolben, die bei 37 °C gehalten werden, und 5 %CO2auf 80-85% Konfluenz wachsen. Sobald die Zellen die ideale Koninfluenza erreicht haben, dekantieren Sie die Medien aus Kolben und waschen Sie sie zweimal mit warmer (37°C), steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS), genug, um die Monoschicht von anhaftenden Zellen abzudecken. Pipette der verbleibenden PBS nach der letzten Wäsche. Fügen Sie warme (37°C) 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung (0,5% Stock Trypsin-EDTA verdünnt 1:10 in Hanks’-basierte enzymfreie Zelldissoziationspuffer) hinzu, um die Monoschicht in jedem Kolben zu bedecken und bei 37°C für 3-5 Minuten zu brüten oder bis sich die Zellen mit Demonpfen an den Seiten des Flasche. Fügen Sie 10-25ml Kälte (4°C), sterile TC-Medien in jeden Kolben, um die Trypsinisierungsreaktion zu stoppen. Zellsuspension in eine 50ml konische(s) gießen, mit kalten TC-Medien auf 50 ml füllen. Zentrifuge bei 300g für 5 Minuten bei 4°C. Überstand entsorgen und Pellet in kaltem, sterilem DMEM (serumfrei) wieder aufsetzen. Wenn mehrere konische Rohre verwendet wurden, um Zellen zu sammeln, können alle Pellets in diesem Schritt zu einem einzigen konischen kombiniert werden. Zentrifuge bei 300g für 5 Minuten bei 4°. Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.7 zweimal. In der endigen Wäsche, nehmen Sie ein Aliquot von Zellen zum Zählen. Für In-vivo-Injektionen wird eine Zelllebensfähigkeit von 90 % empfohlen. Bereiten Sie eine gleichmäßige Suspension der PDA-Tumorzellen bei der gewünschten Konzentration von Tumorzellen vor. Wir verwendeten 10-20 x 106 Zellen/ml (250.000 bis 500.000 Zellen/25-L) in der entsprechenden Menge an sterilem, kaltem DMEM oder PBS, aber jede Zelllinie sollte in vivotitriert werden. Halten Sie zellenkalt, auf Eis, bis sie bereit sind zu injizieren. 2. Prächirurgische Präparation von Mäusen HINWEIS: Dieser Schritt wird empfohlen, 24 Stunden vor dem Eingriff durchzuführen. Legen Sie Käfige mit experimentellen Mäusen auf einen wärmeren Satz von 37°C. Erhalten Sie neue, saubere Käfige und legen Sie sie auf eine zweite Erwärmungsplattform, die auf 37°C eingestellt ist. Reinigen Sie den biologischen Sicherheitsschrank, die Induktionskammer und die Ultraschallstufe (US) gründlich mit Sterilmittel (siehe Materialtabelle). Drehen Sie die Erwärmungsfunktion der US-Stufe auf 37°C. Anästhesiemaschine einschalten: Stellen Sie die Zifferblätter am Rohrteiler so ein, dass der Luftstrom nur auf die Induktionskammer beschränkt ist. Schalten Sie den Sauerstofftank ein und stellen Sie die Durchflussrate auf 1 L/min ein. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer auf 2-3% ein. Legen Sie eine einzelne Maus in die Induktionskammer. Überwachen Sie die Maus, bis sie nicht mehr mobil ist und die Atmung verlangsamt wurde. Stellen Sie die Zifferblätter am Splitter so ein, dass der Luftstrom sowohl der Induktionskammer als auch dem Nasenkegel gestattet ist. Bewegen Sie die Maus schnell aus der Induktionskammer und legen Sie sie in ventraler Recumbency auf die warme US-Bühne mit ihrer Schnauze im Nasenkegel. Testen Sie den Grad der Induktion, indem Sie eine reflexive Reaktion auf das Kneifen von Zehen beobachten. Wenn es keine gibt, ist die Maus bereit für die Haarentfernung. Legen Sie eine kleine Menge Augenschmierstoff (siehe Materialtabelle)auf beide Augen, um Gewebeaustrocknung zu verhindern. Drehen Sie die Maus so, dass sie in dorsaler Rekumbency auf der Bühne liegt. Befestigung der oberen und unteren Extremitäten mit Papierband an der Bühne, um die Belichtung des Bauches zu maximieren und die Maus auf der Bühne zu sichern. Verwenden Sie einen sterilen Baumwoll-Spitzen-Applikator, um eine großzügige Schicht Enthaarungscreme auf den oberen linken Quadranten des Bauches aufzutragen. Die Enthaarung sollte im allgemeinen Bereich der Milz angewendet werden und sich in Richtung der Mittellinie erstrecken. Lassen Sie etwa eine Minute sitzen. Testen Sie den Grad der Haarentfernung, indem Sie sanft das gegenüberliegende Ende des Baumwollspitzen-Applikators verwenden, um die Enthaarungscreme wegzuwischen, sobald sie leicht entfernt wird, wischen Sie den Bauch mit einem trockenen Gazepad sauber. Dann eine saubere Schicht Gaze mit einer kleinen Menge warmer Saline nass machen und den Bereich noch einmal abwischen, um das Enthaarungsmittel vollständig zu entfernen. Überschreiten Sie nicht 2 volle Minuten direkten Kontakt auf der Maushaut, um die Wahrscheinlichkeit chemischer Verbrennungen zu reduzieren. Sobald das Haar ausreichend aus dem Bauch entfernt wurde, kehren Sie die Maus zu einem neuen, sauberen Käfig auf wärmer zurück. Während das erste Tier auf der US-Bühne einer Haarentfernung unterzogen wird, kann das nächste Tier der Induktionskammer hinzugefügt werden. Bevor Sie den nächsten Käfig von Mäusen anästhesieren, schalten Sie das Isofluran aus und spülen Sie die Induktionskammer mit Sauerstoff. Reinigen Sie die Induktionskammer und den US-Stufen-/Nasenkegel mit Sterilant. Wiederholen Sie die Schritte 2.5-2.14, bis alle Käfige und Mäuse einer Haarentfernung unterzogen wurden.HINWEIS: Fastentiere durch vorübergehende Entnahme von Lebensmitteln für einen Zeitraum vor der Implantation können in Betracht gezogen werden, um die visuelle Obstruktion der Bauchorgane durch unverdaute Nahrung in Magen und Darm zu minimieren (12-24 Stunden). Wasserbeschränkung wird nicht empfohlen. Wenn Tiere gefastet werden, wird empfohlen, dass sie mit einer Injektion von 1ml warm (37°C), steriler Herzsäure nach Tumorinjektion behandelt werden, um Austrocknung zu verhindern. 3. Ultraschall-geführte Implantation von PDA-Zellen HINWEIS: Alle Ultraschallverfahren werden mit Ultraschall-Bildgebungsmaschine und -software durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien). Der Messumformer hat eine Mittelfrequenz von 40 MHz und eine Bandbreite von 22-55 MHz. Stellen Sie die Ultraschallplattform so ein, dass die Plattformoberfläche parallel zum Boden ist und der Prüfer mit dem Kopf des Tieres nach rechts zur linken Seite des Tieres zeigt. Stellen Sie die Wandlerposition so ein, dass ein queres Bauchbild erhalten wird (Abbildung 1A). Anästhetisieren Sie die Maus, die in die Schritte 2.1-2.8 injiziert werden soll. Stabilisieren Sie die Maus auf der US-Plattform, wie in Schritt 2.9 beschrieben. Tragen Sie eine großzügige Menge an warmem (37°C) Ultraschallgel auf den haarlosen Bauchabschnitt auf. Senken Sie den Messumformer vorsichtig, um den Mausbauch zu berühren. Passen Sie den Messumformer nach Bedarf an, bis die Bauchspeicheldrüse deutlich sichtbar ist. Suchen Sie die linke Niere und Milz, um eine genaue Orientierung der Bauchhöhle zu bieten.HINWEIS: Da die Wandlerposition geändert wurde, um den Zugriff auf die linke Seite des Bauches zu ermöglichen, werden die X- und Y-Achse auf den Bühnensteuerungen nun invertiert. Laden Sie eine 29G x 1/2″ Insulinspritze (siehe Materialtabelle)mit 25 l Tumorzellsuspension. Nadelspitze vor der Injektion mit sterilem Alkohol-Vorbereitungspad abwischen, um die Tumorzellaussaat in der Bauchwand zu minimieren. Mit stumpfkantigen Zangen, greifen Sie die Haut und Peritonealwand, um die Spannung an der gewünschten Injektionsstelle zu erhöhen. Halten Sie die Spritze in etwa einem Winkel von 25°-45° zur Oberfläche der Ultraschallplattform, bringen Sie die Nadel langsam durch die Haut und die Peritonealwand vor. Bestätigen Sie, dass die Nadel durch die Peritonealwand durchbohrt wurde, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Ein kleiner Knall sollte zu spüren sein, wenn die Nadel die Peritonealwand durchbohrt. Führen Sie die Nadel unter Ultraschall-Visualisierung direkt in die Bauchspeicheldrüse (Abbildung 1B-C). Bestätigen Sie, dass sich die Nadel im Bauchspeicheldrüsengewebe befindet, indem Sie den Spritzenlauf vorsichtig nach oben und unten bewegen. Wenn die Platzierung korrekt ist, bleibt die Nadelspitze im Bauchspeicheldrüsengewebe, während sich der Spritzenlauf bewegt. Injizieren Sie langsam die Tumorzellen und bestätigen Sie, dass die Zellen an der gewünschten Stelle durch die Bildung eines flüssigen Bolus innerhalb der Bauchspeicheldrüse implantiert werden (sichtbar auf dem Ultraschallbildschirm, Abbildung 1D).HINWEIS: Einige Widerstände sollten beim Drücken des Kolbens zu spüren sein. Achten Sie darauf, die Bauchspeicheldrüse nicht mehrmals zu durchbohren, da dies die Wahrscheinlichkeit eines Lecks in die Bauchhöhle erhöht. Sobald das volle Volumen der Suspension injiziert wurde und ein flüssiger Bolus in der Bauchspeicheldrüse zu sehen ist, halten Sie die Nadel für einige Sekunden sehr still. Langsam zurückziehen Nadel aus dem Mausbauch, mit großer Sorgfalt nicht die injizierten Zellen stören. Legen Sie die Maus in einen sauberen, warmen Käfig und stellen Sie sicher, dass sich die Maus vollständig von der Anästhesie erholt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Tiere. Vor der Anästhesisierung der nächsten Maus, reinigen Sie die Induktionskammer und US-Stufen-/Nasenkegel mit Sterilant. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.11, bis alle Mäuse injiziert wurden.

Representative Results

Ziel dieses Berichts war es, ein detailliertes Protokoll für die Durchführung von Ultraschall-geführten Implantationen von KPC-abgeleiteten PDA-Zelllinien bereitzustellen. In den repräsentativen Experimenten in Abbildung 2-4bestätigen wir, dass UG-OTIM-Tumoren mit einer konstanten Rate und in einer dosisabhängigen Weise wachsen. Darüber hinaus zeigen wir, dass UG-OTIM-Tumoren die wichtigsten immunologischen und histologischen Merkmale des KPC TME rekapitulieren. Somit ist das UG-OTIM-System ein präklinisches PDA-Mausmodell, das in hochdurchsatzweise verwendet werden kann, um neue Behandlungskombinationen in vivoschnell abzuschirmen. Mit dem hier beschriebenen UG-OTIM-Protokoll wurden die Mäuse für die Implantation vorbereitet, an der beheizten Ultraschallplattform befestigt und die Positionen sowohl der Plattform als auch des Messumformers für dieses Verfahren angepasst, wie in Abbildung 1Adargestellt. Hochauflösende Ultraschall-Bildgebung wurde verwendet, um eine Injektionsstelle innerhalb der Maus Bauchspeicheldrüse zu identifizieren, die ohne Perforation der Niere oder Milz gezielt werden konnte (Abbildung 1B). Unter ultrasonographischer Visualisierung wurde die Nadel sorgfältig durch die Peritonealwand in die Bauchhöhle eingeführt und in die Bauchspeicheldrüse der Maus geführt (Abbildung 1C). Nach korrekter Platzierung der Nadel wurde die Tumorzellsuspension sehr langsam in die Bauchspeicheldrüse injiziert. Eine erfolgreiche Implantation wurde durch das Vorhandensein einer Blase in der Bauchspeicheldrüse bestätigt (Abbildung 1D). In frühen Experimenten wurde die Maus geopfert, und die Wirksamkeit des Verfahrens wurde durch direkte Visualisierung eines flüssigen Bolus im groben Bauchspeicheldrüsengewebe überprüft (Abbildung 1E). Die Tumorimplantation und die Wachstumsrate wurden durch wöchentliche Ultraschall-Bildgebung überwacht. Erfolgreiche Implantationen produzierten Tumore, die während der gesamten Zeit des Experiments innerhalb der Grenzen der Bauchspeicheldrüse enthalten waren (Abbildung 2A). Die verwendete Ultraschallsoftware (siehe Materialtabelle) ermöglichte es, Tumorbereich und Volumen für jeden Zeitpunkt zu bestimmen sowie 3D-Mapping von gemessenen Tumoren zu generieren (Abbildung 2B), und die 3D-Bilder wurden zum Zeitpunkt der Mausnekropsie bestätigt (Abbildung 2C). Eine unsachgemäße Zellinjektion während des UG-OTIM-Verfahrens kann zur Entwicklung eines peritonealen Wandtumors führen (ein repräsentatives Bild davon ist in Abbildung 2Ddargestellt). Mäuse, die mit Peritonealtumoren vorhanden sind, können von weiteren Studien ausgeschlossen werden. Um die Konzentration von Zellen optimal für den Einsatz in präklinischen Studien zu bestimmen, wurde in sechs unabhängigen Experimenten eine von C57Bl/6 KPC abgeleitete PDA-Zelllinie (4662)9 in naive, wilde C57Bl/6-Mäuse injiziert. Diese Zelllinie (sechsmal in vitro durchzogen) wurde von einer vollständig zurückgekreuzten KPC-Tumor-haltigen Maus (>10 Generationen, bestätigt durch SNP-Analyse19) abgeleitet, um molekulare Histokompatibilität komplexe Missübereinstimmung Tumorabstoßungsantigene zu verhindern. Tumorzellen wurden mit einer niedrigen Titerdosis (1,25 x 106 Zellen/25-L) und einer hohen Titerdosis (5 x 106 Zellen/25-L) injiziert. Die Hochtiter-Tumor-Injektionen führten drei Wochen nach injektionn zu einem größeren Anteil tumortragender Tiere im Vergleich zur Low Titer-Kohorte (Abbildung 3A). Trotz der Verzögerung beim Tumorbeginn war die Gesamttumorwachstumsrate zwischen den beiden Dosen nicht signifikant unterschiedlich (Abbildung 3B). Auch wenn sich die Überlebensrate zwischen den beiden Kohorten nicht signifikant unterscheidet, ist der Datentrend zu einem leicht verbesserten Überleben in der Niedertiterkohorte (Abbildung 3C). Die High Titer-Kohorte produzierte auch einen größeren Anteil von Mäusen mit Tumoren, die in präklinischen Studien eingeschrieben waren (mit einem Tumorvolumen von 20 mm3) um vier Wochen nach der Injektion als die niedrige Titerkohorte(Abbildung 3D). Die Mehrheit der Mäuse aus hohen und niedrigen Titer-Kohorten präsentierte sich mit eingeschriebenen Tumoren bis zum 25. Tag und entwickelte Symptome von Endstadium-Erkrankungen, einschließlich Aszites (Daten nicht gezeigt). Metastasen, die nicht mit 4662 bei den Zelldosen aus diesem Protokoll auftreten, können mit verschiedenen Zelllinien oder Dosen33modelliert werden. Die UG-OTIM-Methode erforderte eine Beherrschung der Feinmotorik, um die gewünschte Injektionsstelle genau zu lokalisieren, was in unseren frühesten Experimenten eine Herausforderung darstellte. Aus diesem Grund haben wir eine Tabelle mit der Anzahl der Tiere, die Tumore innerhalb der Bauchspeicheldrüse entwickelt haben (erfolgreiche Implantationen), im Vergleich zur Gesamtzahl der Tiere, die ultraschallgesteuerte Tumorimplantation unterzogen wurden (Tabelle 1). Tiere wurden aus zukünftigen Analysen eliminiert, wenn sich Tumore an einem unerwünschten Ort (d. h. der Niere) entwickelten oder ob es keine Hinweise auf einen Tumor nach sechs Wochen nach der Injektion gab, wie angegeben. Die wöchentliche Progression des Anteils der Mäuse mit eingeschriebenen Bauchspeicheldrüsentumoren (ca. 20mm3 Tumorvolumen) aus jedem Experiment ist auch in Tabelle 1dargestellt. Um festzustellen, ob es einen Vorteil bei der Verwendung des UG-OTIM-Ansatzes und nicht des traditionellen chirurgischen orthotopischen Modells (über die Zeitinvestition hinaus nach dem Erwerb von Kenntnissen in der Technik) gab, verglichen wir die Aussaat von PDA-Tumoren in der Peritonealwand von Mäusen nach jedem Eingriff. Wir fanden heraus, dass nur 2/31 Mäuse (6,5%) entwickelte unbeabsichtigte peritoneale Wandtumoren nach UG-OTIM-Injektionen, im Vergleich zu 7/15 Mäusen, die peritoneale Wandtumoren nach chirurgischer Injektion entwickelten (46,6%, p < 0,0029) (Tabelle 1). So ist die Rate der Aussaat zusätzlicher Tumoren im Peritoneum bei der UG-OTIM-Methode im Vergleich zur chirurgischen Implantation stark reduziert. Nach dem Opfer von Mäusen, die UG-OTIM-Tumoren trugen, stellten wir fest, dass die grobe Anatomie der Tumoren spontanen KPC-Tumoren ähnelte (Abbildung 4A). Die histologische Analyse zeigte ein Muster abnormer duktaler Strukturen, das in beiden Modellen ähnlich war und die Morphologie der menschlichen Krankheit rekapitulierte (Abbildung 4B). Zur Untersuchung des Immuninfiltrats sowohl innerhalb von KPC- als auch in UG-OTIM-Tumoren wurden repräsentative histologische Proben für CD3 (ausgedrückt durch T-Zellen) und F4/80 (ausgedrückt durch Makrophagen) gefärbt. In beiden Modellen ergaben Färbemuster Tumore, die von T-Zellen schlecht infiltriert wurden (Abbildung 4C), aber stark durch Makrophagen infiltriert (Abbildung 4D). Dieser Befund steht im Einklang mit dem immunologisch kalten Phänotyp der meisten humanen und KPC PDA-Proben5,7,12. Abbildung 1: Ultraschall-geführte Implantation von PDA-Zellen in die murine Bauchspeicheldrüse. (A) Orientierung der Maus, Ultraschallstufe und Ultraschallsonde verwendet, um ein hochauflösendes Bild der Bauchorgane zu erhalten. Beachten Sie, dass Die Bühne und plattform um 90° von der Standardausrichtung gedreht wurden, um einen einfachen Zugriff auf den oberen linken Quadranten des Mausbauchs zu ermöglichen. (B) Ultrasonografisches Bild, das die Identifizierung von Niere, Milz und Bauchspeicheldrüse darstellt. Hier wird die Injektionsnadel gegen den Mausbauch positioniert. (C) Ultrasonografisches Bild, das die Nadel in der Bauchspeicheldrüse der Maus darstellt. (D) Ultrasonografisches Bild, das die Blase an der Injektionsstelle (blau umrandet) nach kontrollierter Injektion von Tumorzellen in die Bauchspeicheldrüse darstellt. (E) Laparotomie, die den flüssigen Bolus, der PDA-Zellen in der Bauchspeicheldrüse enthält, nach ultraschallgeführter Injektion enthüllt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Überwachung des Tumorwachstums nach der UG-OTIM-Injektion. (A) Repräsentatives ultrasonographisches Bild des UG-OTIM-Tumors (blau umrandet) bei 2, 3 und 5 Wochen nach der Injektion, wie angegeben. (B) Repräsentativ rekonstruiertes 3D-Bild des UG-OTIM-Tumors 5 Wochen nach der Injektion mit der Ultraschall-Software. (C) Repräsentative Grobe Anatomie des UG-OTIM-Tumors 5 Wochen nach der Injektion auf Mausnekropsie. (D) Repräsentatives ultrasonographisches Bild eines peritonealen Wandtumors, der in der subkutanen Schicht nach unsachgemäßer Zellinjektion nach 7 Wochen nach der Injektion wächst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Dosisabhängiges Beginn von einschreibungsfähigen Tumoren nach Ultraschall-geführter Injektion von PDA-Zellen. (A) Anteil der tumortragenden Mäuse an angegebenen Zeitpunkten nach der Injektion, wie in Abbildung 1 beschrieben, mit Hochtiter (500.000 Zellen/25-L) oder niedrig geiteren (125.000 Zellen/25-L)-Tumorzellen, wie angegeben. (B) Tumorwachstumskinetik von Mäusen aus (A), jedes Symbol stellt eine Gruppe von Mäusen dar, Fehlerbalken zeigen SEM an. (C) Anteil der Mäuse aus (A) lebendig zu angegebenen Zeitpunkten nach der Injektion. Mäuse wurden eingeschläfert oder zensiert, wenn Tumore >1000mm3 oder Körperzustand war schlecht aufgrund von Tumorkomorbiditäten. (D) Zeit für den einschreibenden Tumorbeginn für Mäuse aus (A). Einfetzbare Tumoren werden als 20 mm3 im Volumen betrachtet. Daten repräsentativ für 4 unabhängige Experimente mit n=8-20 Mäusen/Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Experiment Pankreas-Tumor-Lager/Gesamtinjektionen Woche 1 (einschreibungsfähig) Woche 2 (anmeldend) Woche 3 (anmeldend) Woche 4 (anmeldend) Gesäte Peritoneale Tumoren High Titer 24/31 Nd 8/24 (3/24) 15/24 (7/24) 23/23 (20/23) 2/20 Low Titer 11/17 Nd 3/11 (0/11) 6/11 (3/11) 9/11 (5/11) 0/11 Chirurgische Injektion 15/17 Nd Nd 15/15 (9/15) 15/15 (14/15) 7/15 Tabelle 1: Anzahl der erfolgreichen UG-OTIM-Tumoren im Vergleich zur chirurgischen Implantation. Daten kombiniert aus 2-4 unabhängigen Experimenten pro hoher oder niedriger Titer-Bedingung mit n=5-10 Mäusen pro Experiment. “Chirurgische Injektion” zeigt Mäuse, die abdominale laparoskopische chirurgische Injektion von 125.000 Tumorzellen erhalten. “Tumor-lagernd” zeigt Mäuse mit einem Bauchspeicheldrüsentumor an. “Enrollfähig” gibt den Anteil der tumortragenden Mäuse zu jedem Zeitpunkt mit einem Tumorvolumen >20mm3an. “Seeded Peritoneal Tumors” gibt den Gesamtanteil der tumortragenden Mäuse an, die gleichzeitig Tumore an der Peritonealwand aus der Tumorzellinjektion aussäen. Mäuse mit Tumoren, die in anderen Geweben als der Bauchspeicheldrüse (d. h. der Niere) falsch vorhanden waren, wurden von “tumortragenden” Populationen ausgeschlossen (aber in insgesamt injizierten Mäusen enthalten). ND, nicht bestimmt. Häufigkeit der peritonealen Wandsaat, die hohe und niedrige Titergruppen kombiniert mit chirurgischer Implantation vergleicht, p < 0.0029 über 2-tailed T Test mit Mann-Whitney post-test. Abbildung 4: UG-OTIM-Tumoren rekapitulieren die KPC-Tumormikroumgebung. Repräsentative Bilder werden angezeigt. Obere Reihe, KPC-Tumoren. Untere Reihe, UG-OTIM-Tumoren bei 5 Wochen nach der Implantation. (A) Bruttoanatomie der ausgeschnittenen Tumoren auf Nekropsie. (B) H&E (10X, bar=100m) (C) Immunohistochemie Färbung für CD3 (braun) (10X, bar=100 m). (D) Immunfluoreszenzfärbung von F4/80 (rot) und DAPI (blau) (4X, bar=500 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Wir zeigen hier, dass der Einsatz hochauflösender Ultraschallzurpfinfektion zur direkten Implantation von murinen PDA-Zelllinien auf die autochthone Gewebestelle eine zuverlässige Alternative sowohl zu den KPC- als auch zu den chirurgischen orthotopischen Modellsystemen ist. UG-OTIM produziert biologisch relevante Tumoren, die die immunpathologischen Merkmale von PDA mit einem verkürzten Zeitrahmen für die Tumordiagnose und einer zuverlässigen Tumorwachstumskinetik beibehalten. Ultraschallgeführte Injektion kann daher als nützliches Werkzeug für die schnelle Produktion von Mäusen dienen, die orthototisch implantierte PDA-Tumoren tragen, was die Untersuchung von therapeutischen Kombinationen in einem klinisch relevanten Modell ermöglicht.

Die Ultraschall-geführte Implantation bietet wichtige Verbesserungen gegenüber Standardmodellen der präklinischen Untersuchung. Erstens eliminiert dieses Verfahren die zeitintensive Überwachung von KPC-Mäusen zur Entwicklung spontaner Tumoren durch direkte Implantation vollständiger C57BL/6-Rückkreuz-PDA-Zellen in die murine Bauchspeicheldrüse. Zweitens ermöglicht der UG-OTIM-Ansatz ähnlich wie bei herkömmlichen chirurgischen orthotopischen Injektionen die Kontrolle über die injizierte Zelllinie, einschließlich der Auswahl einer monoklonalen Tumorzelllinie und/oder Ex-vivo-Manipulation der Zelllinie sowie die Kontrolle über den Wirt, der die Tumorzellimplantation erhält. Drittens vermeidet diese minimalinvasive Technik die mühsame Arbeit der Überlebensoperation und umgeht die komplizierte postoperative Erholungsphase für die Tiere sowie entzündliche Signale aus der chirurgischen Wundheilung. Schließlich rekapitulieren UG-OTIM-Tumoren – ähnlich wie bei der chirurgischen Implantation – das bei den KPC-Mäusen beobachtete TME, einschließlich niedriger T-Zell-Infiltration und hoher Makrophageninfiltration. So behält das UG-OTIM-Modell die Hauptmerkmale der KPC-Tumoren ohne die zusätzlichen Komplikationen bei, die therapeutische Untersuchungen im spontanen KPC-Modell verzögern.

Eine Reihe wichtiger Schritte im Protokoll sind der Schlüssel zum Beherrschen des Erfolgs der Technik. Die Expertise in der murinen Ultraschall-Bildgebung ist für dieses Verfahren unerlässlich, aber die manuelle Geschicklichkeit, die erforderlich ist, um Zellen erfolgreich in die Bauchspeicheldrüse zu implantieren, ist eine Fähigkeit, die unabhängig entwickelt werden muss. Für Mäuse in einem 12-stündigen Licht-/Dunkelzyklus sorgte das Fasten der Tiere über Nacht dafür, dass Magen und Darm von unverdauten Lebensmitteln befreit wurden, die den Blick auf Bauchspeicheldrüse, Niere und Milz durch Ultraschall versperren konnten. Zusätzlich sollte jede Zelllinie, die für die orthotopische Injektion verwendet wird, vor weiteren Experimenten titriert werden, um die Wachstumskinetik zu verstehen und das metastasierende Potenzial33zu bestimmen. Während der Injektion erzeugte die Verwendung von Zangen, um die Haut an der Injektionsstelle zu kneifen, die Spannung, die notwendig ist, um sanft durch die Haut und die Peritonealwand zu punktieren. Ein wichtiger Schritt in dem Verfahren war es, die Nadel sorgfältig in die Bauchspeicheldrüse zu führen, ohne das Gewebe zu perforieren oder eine Off-Target-Stelle wie die Milz oder Niere zu durchkreuzen. Die Bestätigung eines flüssigen Bolus war der beste Indikator für eine erfolgreiche Tumorzellinjektion im richtigen Gewebe. Nach der Injektion sollte die Nadel langsam entnommen werden, um den Flüssigbolus nicht zu stören. Wir fanden heraus, dass eine Reihe von Versuchsinjektionen mit DMEM oder Trypan Blue dazu beitrug, die für diese Injektion erforderlichen Feinmotorik zu beherrschen.

Bei der Fehlerbehebung für dieses Verfahren haben wir eine Reihe von Faktoren identifiziert, die sich auf den Erfolg des Protokolls ausgewirkt haben. In Versuchsexperimenten war unser häufigster Fehler die Perforierung der Niere während der Implantation, die häufiger in unseren frühen Experimenten auftrat, was darauf hindeutet, dass regelmäßige Sexercisei diese Fähigkeit verbessert. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Bestätigung des Vorhandenseins eines flüssigen Bolus nach Tumorzellinjektion sowohl über Ultraschall als auch durch direkte Visualisierung bei Nekropsie während der Fehlerbehebungsphase die erfolgreiche Injektionstechnik verbesserte. Wenn die Bildung einer Blase während der Injektion nicht durch Ultraschall bestätigt wird, kann die Position der Nadel vor vollständiger Deprimation der Spritze eingestellt werden, um den verbleibenden Bolus von Tumorzellen freizusetzen. Wir beobachteten auch, dass Suspensionsvolumina zu schnell injiziert führten, was dazu führte, dass Tumorzellen in die Peritonealhöhle verschüttet wurden oder der Flüssigkeitsbolus in der Bauchspeicheldrüse zusammenbrach. Im Allgemeinen entwickelten diese Tiere Bauchspeicheldrüsentumoren mit Ausnahme von n=7-Tieren, die 4 Wochen nach der Injektion keine Hinweise auf einen Tumor zeigten. Dieses Ergebnis wurde nur in unseren ersten Versuchen berichtet (und 6/7 Tiere wurden mit einem niedrigen Titer von Tumorzellen injiziert). Mäuse, die fragwürdige Tumorzellinjektionen haben oder eine Neupositionierung der Nadel erfordern, sollten genau auf die Entwicklung von Tumoren außerhalb der Bauchspeicheldrüse überwacht werden.

Die wichtigsten Einschränkungen der Ultraschall-geführten Methode sind die Verfügbarkeit der benötigten Instrumente und die technischen Fähigkeiten, die mit der Tumorimplantation verbunden sind. Das Verfahren ist nicht vollständig steril, da die Maus nicht steril auf die Ultraschallplattform injiziert wird, wobei die Spritze und nadelspitze durch das Ultraschallgel gehen. Obwohl wir seit Beginn dieser Studien keine Anzeichen einer Infektion bei n=148 Mäusen in insgesamt 8 unabhängigen Experimenten gesehen haben, ist es möglich, dass ein infektiöser Erreger während dieses Prozesses über die Injektionsnadel in die Bauchspeicheldrüse gelangen könnte. Daher sollten so viele Aspekte des Protokolls wie möglich (einschließlich Handschuhe, Ultraschalloberflächen, Eisboxen) mit Desinfektionsmittel oder 70 % Ethanol besprüht werden, um die potenzielle Exposition gegenüber Krankheitserregern zu verringern. Eine zusätzliche Einschränkung des aktuellen Protokolls war das Fehlen von Metastasen mit der 4662-Zelllinie bei den aktuellen Verdünnungen. Jede im UG-OTIM-System verwendete Zelllinie sollte für die gewünschten Wachstumsraten sowie das metastasierende Potenzial33titriert werden. Schließlich etablierte unser aktuelles Protokoll Techniken zur Injektion von Tumorzellen in eine einzellige Suspension. Jedoch könnte die Zugabe eines extrazellulären Matrixsubstrats hinzugefügt werden, um die Tumoreinrichtung potenziell zu verbessern und die Leckage von Tumorzellen zu verhindern (wie es in chirurgischen Implantationsmodellen27,30,31,32) verwendet wird. So können viele der Einschränkungen von UG-OTIM durch entsprechende Tests der Zelllinien, die in den orthotopischen Injektionen verwendet werden, überwunden werden.

Zusammenfassend ist das UG-OTIM-Modell eine präzise Methode der gewebegesteuerten Injektion von Tumorzellen in die murine Bauchspeicheldrüse. Diese minimalinvasive Implantationstechnik kommt sowohl dem Prüfer als auch den Tieren zugute, da sie die Prozesszeit verkürzt, postoperative Komplikationen minimiert und die Genauigkeit der Injektion verbessert. Tumoren, die aus UG-OTIM-Injektionen entstehen, behalten die charakteristischen immunbiologischen Merkmale spontaner KPC-Tumoren bei, haben zuverlässige Zeit bis zum Tumorbeginn und reproduzierbare Tumorwachstumskinetik. So kann das UG-OTIM-Modell in relativ hoher Durchsatzweise eingesetzt werden, um therapeutische Kombinationen in einem präklinischen Umfeld abzuhören, um neuartige Behandlungen für Patienten mit dem größten unerfüllten klinischen Bedarf aufzudecken.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Robert Vonderheide und allen Mitgliedern des Labors Vonderheide, allen Mitgliedern des Pankreaskrebs-Mauskrankenhauses, Dr. Ben Stanger, dem Pankreaskrebs-Forschungszentrum der University of Pennsylvania und Devora Delman für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wird durch Fördermittel des Parker Institute for Cancer Immunotherapy Fellow Award (KTB) und des Pancreatic Cancer Research Center an der University of Pennsylvania (CC) unterstützt.

Materials

50 mL Conicals Thomas Scientific 2602A26
Blunt edged forceps Fine Science Tools 11000-12
Cell Dissociation Buffer Thermo-Fisher 13151014
Cotton Tipped swabs Thermo-Fisher 19062614
Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" Thermo-Fisher 8881600145
Depilatory Agent Amazon Nair Body Lotion
DMEM Thermo-Fisher 10-566-016
FBS Gemini Bio-oroducts 100-106
Flask Sigma-Aldrich CLS430825
Forceps (blunt edge) Fine Science Tools 11000-12
Gauze Fisher 13-761-52
Gentamicin Thermo-Fisher 15750060
Induction Chamber VetEquip 941444
Isofluorane Penn Vet Supply VED1350
Isofluorane Vaporizer VetEquip 911103
L-glutamine Thermo-Fisher 25030081
Optixcare MidWest Veterinary Supply 052.50310.3
Paper Tape Medline MMM1530Z5
PBS Thermo-Fisher 14-190-250
Slide warmer C&A Scientific XH-2001
Sterilant (Clidox-S) Fisher Scientific NC0332382 (activator) NC9189926 (base) Needs to be combined according to manufacturer's instructions
Sterile Alcohol prep pad Covidien 6818
Trypsin Thermo-Fisher 15090046
Ultrasound gel Thermo-Fisher 03-34-1LT
Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 Visual Sonics Vevo 2100
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Hay, C. A., Sor, R., Flowers, A. J., Clendenin, C., Byrne, K. T. Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. J. Vis. Exp. (153), e60497, doi:10.3791/60497 (2019).
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