JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Echografie-geleide Orthotopic implantatie van Murine pancreatic Ductal adenocarcinoom

Published: November 19, 2019
doi:
10.3791/60497
, , , ,
1Department of Medicine, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Pancreatic Cancer Mouse Hospital, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 3Abramson Cancer Center, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 4Parker Institute for Cancer Immunotherapy, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania

Summary

We beschrijven een protocol voor de echografie geleide implantatie van Murine-afgeleide alvleesklier ductaal adenocarcinoom cellijnen rechtstreeks in de inheemse tumor site. Deze aanpak resulteerde in alvleesklier tumoren detecteerbaar door echografie scannen binnen 2-4 weken van injectie, en aanzienlijk verminderd de proportie tumor cel zaaien op de peritoneale muur in vergelijking met chirurgische orthotopic implantatie.

Abstract

Het recente succes van immune Checkpoint blokkade bij melanoom en Long adenocarcinoom heeft het gebied van immuno-oncologie gegalvaniseerd en de beperkingen van de huidige behandelingen onthuld, omdat de meerderheid van de patiënten niet reageert op immunotherapie. Ontwikkeling van accurate preklinische modellen om snel nieuwe en effectieve therapeutische combinaties te identificeren zijn essentieel om deze onvervulde klinische behoefte aan te pakken. De alvleesklier adenocarcinoom (PDA) is een canoniek voorbeeld van een immuuncontrolepunt blokkade resistente tumor met slechts 2% van de patiënten die reageren op immunotherapie. De genetisch gemanipuleerde krasG12D +/-; Trp53R172H +/-; PDX-1 CRE (KPC) muismodel van PDA aan menselijke ziekte en is een waardevol hulpmiddel voor het beoordelen van therapieën voor immunotherapie resistent in de preklinische setting, maar tijd tot tumor begin is zeer variabel. Chirurgische orthotopic tumor implantatie modellen van PDA handhaven de immunobiologische kenmerken van de KPC weefsel-specifieke tumor micro Environment (TME) maar vereisen een tijd-intensieve procedure en introduceren afwijkende ontsteking. Hier gebruiken we een echografie-geleide orthotopic tumor implantatie model (UG-OTIM) om niet-invasief KPC-afgeleide PDA-cellijnen rechtstreeks in de alvleesklier van de muis te injecteren. UG-OTIM tumoren groeien in de endogene weefsel site, getrouw recapituleren histologische kenmerken van de PDA TME, en het bereiken van de inschrijving-sized tumoren voor preklinische studies door vier weken na injectie met minimale zaaien op de peritoneale wand. Het UG-OTIM-systeem dat hier wordt beschreven, is een snel en reproduceerbaar tumor model dat kan leiden tot een hoge doorvoer analyse van nieuwe therapeutische combinaties in het Murine PDA TME.

Introduction

Het pancreas adenocarcinoom (PDA) is een notoir agressieve ziekte die ongevoelig is voor de huidige behandelingen, met een dismale overlevingspercentage van 5 jaar van 9%1. PDA heeft onlangs borstkanker overtroffen om de derde leidende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte in de VS te worden en wordt naar verwachting de tweede leidende oorzaak (achter alleen longkanker) in het jaar 20302. Een aantal kenmerken kenmerkend voor de immunologisch ‘ koude ‘ PDA tumor micro Environment (TME)-met inbegrip van hoge infiltratie van immunosuppressieve myeloïde celpopulaties3,4,5,6,7, dichte stromale depositie8,9,10,11, en een gebrek aan T-cellen5,12,13-dragen bij aan het falen van immunotherapieën in PDA14. Daartoe is het gebruik van een klinisch relevant diermodel een essentieel hulpmiddel voor het onderzoeken van de werkzaamheid van nieuwe geneesmiddel combinaties voor immunologisch koude tumoren in vivo.

De genetisch gemanipuleerde krasG12D +/-; Trp53R172H +/-; PDX-1 CRE (KPC) muismodel van PDA nauwkeurig aan Salient klinische aspecten van menselijke PDA, met inbegrip van de moleculaire bestuurders van de ziekte en histopathologische kenmerken15. KPC-tumoren ontwikkelen zich spontaan in volledig immunocompetente muizen, waardoor de therapeutische benaderingen kunnen worden ondervraagd, waaronder chemotherapie16,17, immunotherapie18,19,20,21, en stroma-targeting therapie9,11,22in vivo voorafgaand aan de toediening van deze geneesmiddelen in de klinische proef setting. Ondanks de vele sterke punten als een preklinisch model van PDA, wordt het gebruik van KPC-muizen benadeeld door de zeer variabele progressie van spontane tumor ontwikkeling, omdat het begin van de tumor kan variëren van 4 tot 40 weken (waardoor het onderhoud een grote broed kolonie vereist)15. Bovendien, KPC muizen hebben het potentieel voor polyklonale primaire tumoren23, en er is een snelle afname van de diergezondheid en verhoging van de co-morbiiteiten met inbegrip van cachexia en ascites als ziekte vordert15.

Een alternatief voor het spontane KPC-muismodel is het gebruik van een orthotopic implantatie model van PDA24. De directe chirurgische implantatie van tumor cellijnen in de inheemse weefsel site is een kosteneffectievere en voorspelbare methode om de Weefselspecifieke tumor micro Environment (TME) van PDA te recapituleren. Tumor implantatie maakt injectie van klonale tumor cellijnen aan genetisch backgekruiste muizen5, waardoor voor gastheer muizen met extra genetische manipulaties die tijdrovend zou zijn om te fokken in de KPC muismodel. Echter, alvleesklier tumor implantatie vereist een arbeidsintensieve chirurgische ingreep die afwijkende ontsteking introduceert op de hecht plaats in de buikwand24,25,26, en vaak bevat een lange post-operatieve herstel27,28,29.

Technologische vooruitgang in ultrasone beeldvorming met behulp van knaagdieren-specifieke transducers biedt hoge resolutie beelden in real-time. Geleid door de ultrasone beeldvorming van de injectienaald beweging in de peritoneale Holte, kan men de tumorcellen specifiek in de alvleesklier implanteren, gebruikmakend van de voordelen van orthotopic tumor injecties in de afwezigheid van chirurgische implantatie en bijbehorende ontsteking. Deze aanpak, genoemd echografie-geleide orthotopic tumor implantatie model (UG-Otim) is eerder vastgesteld in een xenotransplantaatmodellen is modellen van pancreaskanker30 evenals in verschillende andere kanker modellen, met inbegrip van Ewing sarcoom, neuroblastoom en blaaskanker31,32.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van echografie geleide injecties van tumor cellijnen in de Murine alvleesklier. We laten zien dat de resulterende tumoren de histologische en immunologische kenmerken van de KPC TME recapituleren en daarom kunnen worden gebruikt om nieuwe therapeutische combinaties, waaronder immunotherapieën, te onderzoeken om snel de meest veelbelovende behandelingen te onthullen om te bewegen door naar de klinische onderzoeken.

Protocol

De protocollen voor dieren zijn beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Comité voor dierenverzorging en-gebruik aan de Universiteit van Pennsylvania. Vrouwelijke 5-tot-6-week oude C57Bl/6 muizen werden aangekocht (Zie tabel van de materialen) en werden gebruikt na 1-3 weken rust. Het universitair laboratorium dierlijke hulpbronnen overzag dierenverzorging. 1. bereiding van PDA tumor cellijnen voor injectie Groeien KPC-afgeleide PDA-cellijn in tumor Cell (TC) media: Dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2mM L-glutamine en 83 μg/mL gentamicin. Laat cellen groeien tot 80-85% confluentie in kolven bij 37 °c en 5% Co2. Als de cellen de ideale confluentie bereiken, decante u de media uit kolven en wast u tweemaal met een warme (37 ° c), steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), genoeg om de monolaag van de aanhanger cellen te bedekken. Pipet van de resterende PBS na de laatste wasbeurt. Voeg warm (37 °C) 0,05% trypsine-EDTA-oplossing (0,5% voorraad trypsine-EDTA verdund 1:10 in op Hanks’-gebaseerde enzym vrije celdissociatie buffer) om de monolaag in elke kolf te bedekken en gedurende 3-5 minuten bij 37 °C te inbrokkelen, of totdat de cellen losraken door te tikken op de zijkanten van de Kolf. Voeg 10-25mL koude (4 °C), steriele TC-media toe aan elke kolf om de trypsinisatie reactie te stoppen. Giet celsuspensie in een 50mL conische (s), vul aan tot 50mL met koude TC media. Centrifugeer bij 300g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi supernatant en respendeer pellet weg in koude, steriele DMEM (serumvrij). Als meerdere conische buizen werden gebruikt om cellen te verzamelen, alle pellets kunnen worden gecombineerd tot een enkele conische bij deze stap. Centrifugeer bij 300g gedurende 5 minuten bij 4 °. Herhaal stap 1.6-1.7 tweemaal. Neem in de laatste wasbeurt een hoeveelheid cellen om te tellen. Levensvatbaarheid van de cel van ≥ 90% wordt aanbevolen voor in vivo injecties. Bereid een uniforme suspensie van de PDA-tumorcellen op de gewenste concentratie van tumorcellen. We gebruikten 10-20 x 106 cellen/mL (250.000 tot 500.000 cellen/25μl) in de juiste hoeveelheid steriele, koude DMEM of PBS, maar elke cellijn moet in vivoworden getitreerd. Houd cellen koud, op ijs, totdat ze klaar zijn om te injecteren. 2. pre-chirurgische bereiding van muizen Opmerking: deze stap wordt aanbevolen om 24 uur vóór de procedure te worden uitgevoerd. Plaats de kooien die experimentele muizen bevatten op een warmere set tot 37 °C. Verkrijg nieuwe, schone kooien en plaats op een tweede verwarmend platform ingesteld op 37 °C. Reinig grondig de biologische veiligheidskast, de inductie kamer en het echografie (VS) podium met sterilant (Zie tabel met materialen). Draai de verwarmende functie van het Amerikaanse podium tot 37 °C. Zet de anesthesie machine aan: pas de wijzerplaten op de buis splitter aan, zodat de luchtstroom alleen beperkt is tot de inductie kamer. Zet de zuurstoftank aan en stel deze in op 1 L/min. Zet de Isofluraan vaporizer aan tot 2-3%. Plaats een enkele muis in de inductie kamer. Monitor de muis tot niet langer mobiel en ademhalen is vertraagd. Pas de wijzerplaten op de splitter aan, zodat de luchtstroom zowel in de inductie kamer als in de neuskegel is toegestaan. Beweeg de muis snel van de inductie kamer en leg het in ventrale ligigheid op de warme US fase met zijn snuit in de neuskegel. Test het niveau van inductie door het observeren van een reflexieve reactie op Teen knijpen. Als er geen is, is de muis klaar voor ontharing. Plaats een kleine hoeveelheid oogsmeer middel (Zie tabel met materialen) op beide ogen om weefsel uitdroging te voorkomen. Draai de muis zodanig dat deze in de dorsale ligigheid in het werkgebied wordt vastgelegd. Hecht de bovenste en onderste ledematen zachtjes aan het podium met papier tape om de blootstelling van de buik te maximaliseren en de muis naar het podium te beveiligen. Gebruik een steriele katoenen tip applicator om een royale laag ontharings Cream toe te passen op de linker kwadrant van de buik. De ontharings moet worden toegepast in het algemene gebied van de milt en zich uitstrekken naar de middenlijn. Laat ongeveer een minuut zitten. Test de mate van ontharing door zachtjes het tegenovergestelde uiteinde van de katoenen tip applicator te gebruiken om de onthardings crème weg te vegen, zodra het gemakkelijk wordt verwijderd, veeg de buik schoon met een droog gaas kussen. Bevochtig vervolgens een schone laag gaas met een kleine hoeveelheid warme zoutoplossing en veeg het gebied opnieuw schoon om het onthardings middel volledig te verwijderen. Niet overschrijden 2 volledige minuten direct contact op de muis huid om de kans op chemische brandwonden te verminderen. Zodra het haar voldoende uit de buik is verwijderd, keert u de muis terug naar een nieuwe, schone kooi op warmere. Terwijl het eerste dier in het Amerikaanse stadium ontharing ondergaat, kan het volgende dier aan de inductie kamer worden toegevoegd. Voordat u de volgende kooi van muizen anesthetiseert, schakelt u de Isofluraan uit en spoelt u de inductie kamer met zuurstof. Reinig de inductie kamer en het Amerikaanse podium/neuskegel met sterilant. Herhaal stap 2.5-2.14 totdat alle kooien en muizen haar verwijdering hebben ondergaan.Opmerking: nuchtere dieren door tijdelijke terugtrekking van voedsel voor een periode voorafgaand aan de implantatie kan worden overwogen om de visuele obstructie van buikorganen te minimaliseren als gevolg van onverteerd voedsel in de maag en darmen (12-24 uur). Water beperking wordt niet aanbevolen. Als de dieren worden gefaald, wordt aanbevolen dat ze worden behandeld met een injectie van 1mL warm (37 ° c), steriele zoutoplossing na tumor injectie om uitdroging te voorkomen. 3. echografie-geleide implantatie van PDA-cellen Opmerking: alle ultrasone procedures worden uitgevoerd met behulp van ultrasone beeldvormings machine en-software (Zie tabel met materialen). De transducer heeft een middelste frequentie van 40 MHz en een bandbreedte van 22-55 MHz. Pas het ECHO platform zodanig aan dat het platform oppervlak evenwijdig is aan de vloer en de onderzoeker tegenover de linkerzijde van het dier staat, met het hoofd van het dier naar rechts. Pas de positie van de transducer aan zodat er een dwarse buik afbeelding wordt verkregen (Figuur 1a). Anesthetiseer de te injecteren muis zoals beschreven in stap 2.1-2.8. Stabiliseer de muis op het Amerikaanse platform zoals beschreven in stap 2,9. Breng een royale hoeveelheid warme (37 °C) ultrageluid gel aan op het haarloze deel van de buik. Verlaag de transducer zachtjes om de buik van de muis te contacteren. Pas de transducer zo nodig aan totdat de alvleesklier duidelijk zichtbaar is. Zoek de linker nier en de milt om een nauwkeurige oriëntatie van de buikholte te bieden.Opmerking: omdat de positie van de transducer is gewijzigd om toegang tot de linkerzijde van de buik mogelijk te maken, zijn de X-en Y-as in de fase regelaars nu omgekeerd. Laad een 29G x 1/2 “insulinespuit (Zie tabel van de materialen) met 25μl tumor celsuspensie. Veeg de punt van de naald met steriele alcohol prep pad voorafgaand aan de injectie om te minimaliseren van tumorcellen zaaien in de buikwand. Met behulp van bot-Edge Tang, pak de huid en peritoneale wand om de spanning op de gewenste injectieplaats te verhogen. Vasthouden van de spuit op ongeveer een 25 °-45 ° hoek naar het ultrageluid platform oppervlak, langzaam vooruit de naald door de huid en de peritoneale wand. Bevestig dat de naald door de peritoneale muur is doorprikt voordat u doorgaat naar de volgende stap. Een kleine pop moet worden gevoeld als de naald de peritoneale muur doorpierent. Leid de naald onder ultrasone visualisatie rechtstreeks in de alvleesklier (Figuur 1B-C). Bevestig dat de naald zich binnen het pancreas weefsel bevindt door de spuitcilinder voorzichtig op en neer te bewegen. Als de plaatsing correct is, blijft de punt van de naald binnen het pancreas weefsel terwijl de spuitcilinder beweegt. Injecteer de tumorcellen langzaam en bevestig dat de cellen op de gewenste plaats worden geïmplanteerd door de vorming van een vloeibare bolus in de alvleesklier (zichtbaar op het echografisch scherm, Figuur 1D).Opmerking: sommige weerstand moet worden gevoeld tijdens het deprimerende plunjer. Wees voorzichtig dat u de alvleesklier niet meerdere malen door prikt, omdat dit de kans op lekkage in de buikholte verhoogt. Zodra het volledige volume van de suspensie is geïnjecteerd en een vloeibare bolus kan worden gezien in de alvleesklier, houd de naald zeer stil gedurende enkele seconden. Langzaam intrekken naald van de buik van de muis, het nemen van de grote zorg niet te storen de geïnjecteerde cellen. Plaats de muis in een schone, warme kooi en zorg ervoor dat de muis volledig is hersteld van anesthesie. Herhaal dit proces voor alle dieren. Reinig de inductie kamer en het Amerikaanse podium/neuskegel met sterilant voordat u de volgende muis verdomoplossend. Herhaal stap 3.2-3.11 totdat alle muizen zijn geïnjecteerd.

Representative Results

Het doel van dit rapport was om een gedetailleerd protocol te bieden voor het uitvoeren van Ultrasound geleide implantatie van KPC-afgeleide PDA-cellijnen. In de representatieve experimenten weergegeven in figuur 2-4, we bevestigen dat UG-Otim tumoren groeien met een consistente snelheid en in een dosis-afhankelijke manier. Verder tonen we aan dat UG-OTIM tumoren de opvallende immunologische en histologische kenmerken van de KPC TME recapituleren. Het UG-OTIM-systeem is dus een preklinisch PDA-muismodel dat op een hoge doorvoer kan worden gebruikt om snel nieuwe behandelings combinaties in vivote scherm. Met behulp van het UG-OTIM-protocol dat hier wordt beschreven, werden de muizen voorbereid op implantatie, vastgezet op het verwarmde ultrasone platform en de posities van zowel het platform als de transducer werden aangepast voor deze procedure zoals weergegeven in Figuur 1A. Ultrasone beeldvorming met hoge resolutie werd gebruikt om een injectieplaats in de alvleesklier te identificeren die kan worden getarget zonder perforatie van de nier of de milt (Figuur 1B). Onder ultrasonografische visualisatie werd de naald zorgvuldig geïntroduceerd in de buikholte door de peritoneale wand en geleid in de muis alvleesklier (Figuur 1C). Na de juiste plaatsing van de naald werd vastgesteld, de tumor celsuspensie werd zeer langzaam geïnjecteerd in de alvleesklier. Een geslaagde implantatie werd bevestigd door de aanwezigheid van een bubbel binnen de alvleesklier (Figuur 1D). In vroege experimenten, de muis werd geofferd, en de werkzaamheid van de procedure werd geverifieerd door het direct visualiseren van een vloeibare bolus in het bruto-pancreas weefsel (Figuur 1E). Tumor implantatie en groeisnelheid werd gemonitord door wekelijkse echografie. Succesvolle implantaties geproduceerd tumoren die waren opgenomen binnen de grenzen van de alvleesklier gedurende de tijd van het experiment (Figuur 2A). De echografie software (Zie tabel van de materialen) gebruikt toegestaan voor tumor gebied en volume te bepalen voor elk tijdstip en voor 3D mapping van de gemeten tumoren worden gegenereerd (Figuur 2B), en de 3D-beelden werden bevestigd op het moment van de muis obductie (Figuur 2C). Een onjuiste celinjectie tijdens de UG-OTIM-procedure kan resulteren in de ontwikkeling van een peritoneale wand tumor (een representatief beeld daarvan wordt weergegeven in Figuur 2D). Muizen die aanwezig zijn met peritoneale tumoren kunnen worden uitgesloten van verdere studies. Om de concentratie van cellen optimaal te bepalen voor gebruik in preklinische studies, werd een C57Bl/6 KPC-afgeleide PDA-cellijn (4662)9 geïnjecteerd in naïeve, wild-type C57Bl/6 muizen in zes onafhankelijke experimenten. Deze cellijn (zes keer in vitro gepasseerd) werd afgeleid van een volledig ruggekruist KPC tumor-dragende muis (> 10 generaties, bevestigd door SNP-analyse19) ter voorkoming van moleculaire histocompatibiliteit complex mismatch tumor afwijzing antigenen. Tumor cellen werden geïnjecteerd bij een lage titer (1,25 x 106 cellen/25μl) en bij een hoge titer (5 x 106 cellen/25μl) dosis. De hoge titer tumor injecties resulteerde in een groter deel van de tumor-dragende dieren drie weken na injecties in vergelijking met de lage titer cohort (Figuur 3a). Ondanks de vertraging in tumor begin, de totale tumorgroei snelheid was niet significant verschillend tussen de twee doses (Figuur 3B). Evenzo, terwijl de overlevingskans tussen de twee cohorten niet significant verschillend was, de trend van de gegevens naar iets verbeterde overleving in het lage titer cohort (Figuur 3C). Het hoge titer cohort produceerde ook een groter deel van de muizen met tumoren die in preklinische studies (aangeduid met ≥ 20mm3 tumor volume) door vier weken na de injectie werden geinbaar dan het lage titer cohort (Figuur 3D). De meerderheid van de muizen van zowel hoge als lage titer cohorten gepresenteerd met indeel bare tumoren op dag 25 en ontwikkelde eindstadium ziektesymptomen met inbegrip van ascites (gegevens niet weergegeven). Metastasen, die niet voorkomen met behulp van 4662 bij de celdoses van dit protocol, kunnen worden gemodelleerd met verschillende cellijnen of doses33. De UG-OTIM-methode vereist een beheersing van de fijne motoriek om de gewenste injectieplaats nauwkeurig te lokaliseren, wat een uitdaging was in onze eerste experimenten. Om deze reden hebben we een tabel opgenomen met het aantal dieren dat tumoren heeft ontwikkeld binnen de alvleesklier (succesvolle implantaties) in vergelijking met het totale aantal dieren dat door echografie geleide tumor implantatie onderging (tabel 1). Dieren werden geëlimineerd uit toekomstige analyses als tumoren ontwikkeld op een ongewenste locatie (dat wil zeggen, nier) of als er geen bewijs van tumor door zes weken na de injectie, zoals aangegeven. De wekelijkse progressie van het aandeel muizen met deelbare pancreas tumoren (≥ 20mm3 tumor volume) van elk experiment wordt ook weergegeven in tabel 1. Om te bepalen of er een voordeel voor het gebruik van de UG-OTIM aanpak in plaats van het traditionele chirurgische orthotopic model (na tijd investering na het verwerven van vaardigheid op de techniek), we vergeleken het zaaien van PDA-tumoren in de peritoneale wand van muizen na elke procedure. We constateerden dat slechts 2/31 muizen (6,5%) ontwikkelde onbedoelde peritoneale wand tumoren na UG-OTIM injecties, in vergelijking 7/15 muizen die peritoneale wand tumoren ontwikkelden na chirurgische injectie (46,6%, p < 0,0029) (tabel 1). Dus, de snelheid van zaaien extra tumoren in het peritoneum is sterk verminderd in de UG-OTIM methode in vergelijking met chirurgische implantatie. Bij het offeren van muizen met UG-OTIM-tumoren, ontdekten we dat de grove anatomie van de tumoren vergelijkbaar was met spontane KPC-tumoren (Figuur 4A). Histologische analyse toonde een patroon van abnormale ductale structuren die vergelijkbaar was in beide modellen en die de morfologie van de menselijke ziekte (Figuur 4B) recapitleerde. Om te onderzoeken van het immuunsysteem infiltreren binnen zowel KPC en UG-OTIM tumoren, representatieve histologische monsters werden gekleurd voor CD3 (uitgedrukt door T cellen) en F4/80 (uitgedrukt door macrofagen). In beide modellen toonden kleurings patronen tumoren aan die slecht geïnfiltreerd werden door T-cellen (Figuur 4C), maar sterk geïnfiltreerd door macrofagen (Figuur 4D). Deze bevinding is consistent met het immunologisch koude fenotype van de meeste humane en KPC PDA-monsters5,7,12. Figuur 1: echografie geleide implantatie van PDA-cellen in de muriene alvleesklier. (A) oriëntatie van de muis, echografie stadium, en ultrasone sonde gebruikt om een hoge resolutie beeld van abdominale organen te verkrijgen. Opmerking de stage en het platform zijn gedraaid 90 ° van de standaardoriëntatie om gemakkelijke toegang tot de linker kwadrant van de muis buik. (B) ultrasonografisch beeld dat de identificatie van de nier, milt en alvleesklier weergeeft. Hier wordt de injectienaald gepositioneerd tegen de buik van de muis. (C) ultrasonografisch beeld dat de naald in de muis alvleesklier afbeeldt. D) ultrasonografisch beeld dat de bel op de injectieplaats afbeeldt (in blauw geschetst) na gecontroleerde injectie van tumorcellen in de alvleesklier. E) laparotomie die de vloeibare bolus met PDA-cellen in de alvleesklier onthult na echografie geleide injectie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: Monitoring van de tumorgroei na UG-OTIM injectie. (A) representatief ultrasonografisch beeld van UG-Otim-tumor (blauw geschetst) bij 2, 3 en 5 weken na de injectie, zoals aangegeven. (B) representatief gereconstrueerd 3D-beeld van UG-Otim tumor 5 weken na de injectie met behulp van de echografie software. C) representatieve bruto anatomie van UG-Otim tumor 5 weken na de injectie bij de muis necropsy. (D) representatief ultrasonografisch beeld van een peritoneale wand tumor die in de onderhuidse laag groeit na onjuiste celinjectie na injectie van 7 weken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: dosis afhankelijk begin van indeel bare tumoren na echografie geleide injectie van PDA-cellen. A) het aandeel tumor dragende muizen op de aangegeven tijdstippen na de injectie, zoals beschreven in Figuur 1 met een hoge titer (500.000 cellen/25μl) of een lage titer (125.000 cellen/25μl) tumorcellen, zoals aangegeven. B) tumor groei kinetiek van muizen van (a), elk symbool vertegenwoordigt een groep muizen, foutbalken geven SEM aan.C) aandeel van muizen van (a) levend op aangegeven tijdstippen na injectie. Muizen werden geëerd of gecensureerd als tumoren > 1000mm3 of lichaamsconditie was slecht als gevolg van tumor comorbiditeiten. (D) tijd voor inschrijf bare tumor aanvang voor muizen van (a). Deelbare tumoren worden beschouwd als ≥ 20mm3 in volume. Gegevens representatief voor 4 onafhankelijke experimenten met n = 8-20 muizen/experiment. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Experiment Alvleesklier-tumor lager/totaal injecties Week 1 (inschrijving) Week 2 (inschrijving) Week 3 (inschrijving) Week 4 (inschrijving) Geseede peritoneale tumoren Hoge titer 24/31 Nd 8/24 (3/24) 15/24 (7/24) 23/23 (20/23) 2/20 Lage titer 11/17 Nd 3/11 (0/11) 6/11 (3/11) 9/11 (5/11) 0/11 Chirurgische injectie 15/17 Nd Nd 15/15 (9/15) 15/15 (14/15) 7/15 Tabel 1: aantal succesvolle UG-OTIM tumoren in vergelijking met chirurgische implantatie. Gegevens gecombineerd van 2-4 onafhankelijke experimenten per hoge of lage titer voorwaarde met n = 5-10 muizen per experiment. “Chirurgische injectie” duidt op muizen die een abdominale laparoscopische chirurgische injectie van 125.000 tumorcellen ontvingen. “Tumor-lager” duidt muizen met een alvleesklier tumor aan. “Inschrijving” geeft het percentage tumor-dragende muizen op elk tijdstip aan met een tumor volume > 20mm3. “Geseede peritoneale tumoren” geeft het totale aandeel van tumor-dragende muizen die gelijktijdig zaaien van tumoren op de peritoneale wand van tumor celinjectie. Muizen met tumoren die onjuist in andere weefsels dan de alvleesklier (d.w.z. nier) voorkomen, werden uitgesloten van “tumor-dragende” populaties (maar opgenomen in totaal geïnjecteerde muizen). ND, niet bepaald. Frequentie van peritoneale wand zaaien vergelijking van hoge en lage titer groepen gecombineerd versus chirurgische implantatie, p < 0,0029 via 2-tailed T test met Mann-Whitney post-test. Figuur 4: UG-Otim tumoren even de KPC tumor micro omgeving. Representatieve afbeeldingen worden weergegeven. Bovenste rij, KPC tumoren. Onderste rij, UG-OTIM tumoren na implantatie na 5 weken. A) macroscopische anatomie van uitgesneden tumoren bij obductie. B) H & E (10x, Bar = 100μm) (C) immunohistochemie kleuring voor CD3 (bruin) (10x, Bar = 100μm). D) immunofluorescentie kleuring van F4/80 (rood) en DAPI (blauw) (4x, Bar = 500μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

We tonen hier dat het gebruik van hoge-resolutie echografie om directe implantatie van Murine PDA cellijnen naar de autochtoon weefsel site is een betrouwbaar alternatief voor zowel de KPC en chirurgische orthotopic modelsystemen. UG-OTIM produceert biologisch relevante tumoren die de immunopathologische kenmerken van PDA behouden met een verkort tijdsbestek voor tumor diagnose en betrouwbare tumorgroei kinetiek. Ultrasone geleide injectie kan daarom dienen als een nuttig hulpmiddel voor snelle productie van muizen met orthotopisch geïmplanteerde PDA-tumoren, waardoor therapeutische combinaties in een klinisch relevant model kunnen worden onderzocht.

Door echografie geleide implantatie biedt belangrijke verbeteringen ten opzichte van standaard modellen van preklinisch onderzoek. Ten eerste elimineert deze procedure de tijdintensieve monitoring van KPC-muizen voor de ontwikkeling van spontane tumoren door het rechtstreeks implanteren van volledig C57BL/6 backgekruiste PDA-cellen in de muriene alvleesklier. Ten tweede, vergelijkbaar met traditionele chirurgische orthotopic injecties, de UG-OTIM aanpak zorgt voor controle over de cellijn geïnjecteerd, met inbegrip van de selectie van een monoklonaal tumor cellijn en/of ex vivo manipulatie van de cellijn, evenals controle over de gastheer ontvangende de tumor cel implantatie. Ten derde vermijdt deze minimaal invasieve techniek de moeizame arbeid van overlevings chirurgie en omzeilt de gecompliceerde postoperatieve herstelperiode voor de dieren, evenals inflammatoire signalen van chirurgische wondgenezing. Tot slot, UG-Otim tumoren-vergelijkbaar met chirurgische implantatie-even de TME waargenomen in de KPC muizen, met inbegrip van lage T cel infiltratie en hoge macrofaag infiltratie. Zo behoudt het UG-OTIM-model de belangrijkste kenmerken van de KPC-tumoren zonder de extra complicaties die therapeutisch onderzoek in het spontane KPC-model vertragen.

Een aantal kritieke stappen in het protocol zijn de sleutel tot Master voor het succes van de techniek. Expertise in Murine ultrasone beeldvorming is essentieel voor deze procedure, maar de handmatige Behendigheid die nodig is om cellen in de alvleesklier met succes te implanteren, is een vaardigheids verzameling die onafhankelijk moet worden ontwikkeld. Voor muizen op een licht/donker cyclus van 12 uur was het vasten van de dieren ‘s nachts verzekerd dat de maag en de darmen werden gewist van onverteerd voedsel dat het zicht op de alvleesklier, nieren en milt door echografie kon blokkeren. Bovendien moet elke cellijn die wordt gebruikt voor orthotopic injectie worden getitreerd voorafgaand aan verdere experimenten om de groei kinetiek te begrijpen en de metastatische potentiaal33te bepalen. Tijdens de injectie creëerde het gebruik van een pincet om de huid op de injectieplaats te knijpen de spanning die nodig was om zachtjes door zowel de huid als de peritoneale wand te prikken. Een belangrijke stap in de procedure was om de naald voorzichtig in de alvleesklier te begeleiden zonder het weefsel te perforeren of een niet-doelsite zoals de milt of de nier in te prikken. Bevestiging van een vloeibare bolus was de beste indicator van succesvolle tumor celinjectie in het juiste weefsel. Na de injectie moet de naald langzaam worden teruggetrokken om de vloeibare bolus niet te verstoren. We vonden dat een reeks van trial injecties met behulp van ofwel DMEM of Trypan Blue hielp om een beheersing van de fijne motoriek die nodig zijn voor deze injectie te ontwikkelen.

Tijdens het oplossen van deze procedure identificeerden we een aantal factoren die het succes van het protocol beïnvloede. In proef experimenten, onze meest frequente fout was het perforeren van de nier tijdens de implantatie, die vaker voorkwamen in onze vroege experimenten suggereren dat regelmatige uitoefening van deze vaardigheid verbetert de vaardigheid. Daarnaast constateerden we dat het bevestigen van de aanwezigheid van een vloeibare bolus na tumor celinjectie via zowel echografie als directe visualisatie bij obductie tijdens de probleemoplossings fase een succesvolle injectietechniek verbeterde. Als de vorming van een bubbel niet wordt bevestigd door echografie tijdens de injectie, kan de locatie van de naald worden aangepast voordat de spuit volledig wordt deprimerend om de resterende bolus van tumorcellen vrij te geven. We hebben ook geconstateerd dat de suspensie volumes te snel geïnjecteerd resulteerde in het morsen van tumorcellen in de peritoneale holte of instorting van de vloeibare bolus in de alvleesklier. In het algemeen, deze dieren ging verder met het ontwikkelen van alvleesklier tumoren met uitzondering van n = 7 dieren die geen bewijs van tumor toonde 4 weken na de injectie. Dit resultaat werd alleen gerapporteerd in onze eerste pogingen (en 6/7 dieren werden geïnjecteerd met een lage titer van tumorcellen). Muizen die twijfelachtige tumor celinjecties hebben, of die herpositionering van de naald nodig hebben, moeten nauwlettend worden gemonitord op de ontwikkeling van tumoren buiten de alvleesklier.

De belangrijkste beperkingen van de echografie geleide methode zijn de beschikbaarheid van de vereiste instrumenten en de technische vaardigheid in verband met tumor implantatie. De procedure is niet volledig steriel, omdat de muis niet-sterilely wordt geïnjecteerd op het echografie-platform, met de spuit en naaldpunt passeren de ultrasone gel. Hoewel we geen bewijs hebben gezien van besmetting in n = 148 muizen over een totaal van 8 onafhankelijke experimenten sinds het initiëren van deze studies, is het mogelijk dat een infectieuze agent de alvleesklier via de injectienaald kan binnengaan tijdens dit proces. Als zodanig moeten zoveel mogelijk aspecten van het Protocol (inclusief handschoenen, ultrasone oppervlakken, ijsdozen) worden besproeid met een ontsmettingsmiddel of 70% ethanol om de potentiële blootstelling aan pathogenen te verminderen. Een extra beperking van het huidige protocol was het ontbreken van metastasen met behulp van de 4662 cellijn bij de huidige verdunningen. Elke cellijn die in het UG-OTIM-systeem wordt gebruikt, moet worden getitreerd voor de gewenste groeisnelheid en metastatische potentiaal33. Tot slot, ons huidige protocol gevestigde technieken voor het injecteren van tumorcellen in een eencellige suspensie. Echter, de toevoeging van een extracellulaire matrix substraat kan worden toegevoegd aan potentieel verbeteren tumor inrichting en voorkomen van tumor cellekkage (zoals het wordt gebruikt in chirurgische implantatie modellen27,30,31,32). Dus, veel van de beperkingen van UG-OTIM kunnen worden overwonnen met de juiste testen van de cellijnen die worden gebruikt in de orthotopic injecties.

Samenvattend, het UG-OTIM-model is een precieze methode van weefsel gerichte injectie van tumorcellen in de muriene alvleesklier. Deze minimaal invasieve implantatie heeft zowel de onderzoeker als de dieren baat bij het verkorten van de procedure tijd, het minimaliseren van postoperatieve complicaties en het verbeteren van de nauwkeurigheid van de injectie. Tumoren die voortvloeien uit UG-OTIM injecties behouden de karakteristieke immunobiologische kenmerken van spontane KPC tumoren, hebben een betrouwbare tijd tot tumor begin, en reproduceerbaar tumorgroei kinetiek. Zo kan het UG-OTIM-model op een relatief hoge doorvoer wijze worden gebruikt om therapeutische combinaties te ondervragen in een preklinische setting om nieuwe behandelingen te onthullen voor patiënten met de grootste onvervulde klinische behoefte.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Dr. Robert Vonderheide en alle leden van het laboratorium Vonderheide bedanken, alle leden van het ziekenhuis pancreatic cancer Mouse, Dr. ben Stanger, het onderzoekscentrum voor alvleesklierkanker aan de Universiteit van Pennsylvania en DEVORA Delman voor nuttige discussies. Dit werk wordt ondersteund door de financiering van het Parker Institute for Cancer immunotherapy Fellow Award (KTB) en het pancreatic Cancer Research Center aan de Universiteit van Pennsylvania (CC).

Materials

50 mL Conicals Thomas Scientific 2602A26
Blunt edged forceps Fine Science Tools 11000-12
Cell Dissociation Buffer Thermo-Fisher 13151014
Cotton Tipped swabs Thermo-Fisher 19062614
Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" Thermo-Fisher 8881600145
Depilatory Agent Amazon Nair Body Lotion
DMEM Thermo-Fisher 10-566-016
FBS Gemini Bio-oroducts 100-106
Flask Sigma-Aldrich CLS430825
Forceps (blunt edge) Fine Science Tools 11000-12
Gauze Fisher 13-761-52
Gentamicin Thermo-Fisher 15750060
Induction Chamber VetEquip 941444
Isofluorane Penn Vet Supply VED1350
Isofluorane Vaporizer VetEquip 911103
L-glutamine Thermo-Fisher 25030081
Optixcare MidWest Veterinary Supply 052.50310.3
Paper Tape Medline MMM1530Z5
PBS Thermo-Fisher 14-190-250
Slide warmer C&A Scientific XH-2001
Sterilant (Clidox-S) Fisher Scientific NC0332382 (activator) NC9189926 (base) Needs to be combined according to manufacturer's instructions
Sterile Alcohol prep pad Covidien 6818
Trypsin Thermo-Fisher 15090046
Ultrasound gel Thermo-Fisher 03-34-1LT
Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 Visual Sonics Vevo 2100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  2. Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
  3. Chao, T., Furth, E. E., Vonderheide, R. H. CXCR2-Dependent Accumulation of Tumor-Associated Neutrophils Regulates T-cell Immunity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 4 (11), 968-982 (2016).
  4. Steele, C. W., et al. CXCR2 Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 29 (6), 832-845 (2016).
  5. Li, J., et al. Tumor Cell-Intrinsic Factors Underlie Heterogeneity of Immune Cell Infiltration and Response to Immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
  6. Beatty, G. L., et al. Exclusion of T Cells From Pancreatic Carcinomas in Mice Is Regulated by Ly6C(low) F4/80(+) Extratumoral Macrophages. Gastroenterology. 149 (1), 201-210 (2015).
  7. Bayne, L. J., et al. Tumor-derived granulocyte-macrophage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and T cell immunity in pancreatic cancer. Cancer Cell. 21 (6), 822-835 (2012).
  8. Beatty, G. L., et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
  9. Lo, A., et al. Tumor-Promoting Desmoplasia Is Disrupted by Depleting FAP-Expressing Stromal Cells. Cancer Research. 75 (14), 2800-2810 (2015).
  10. Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
  11. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of Carcinoma-Associated Fibroblasts and Fibrosis Induces Immunosuppression and Accelerates Pancreas Cancer with Reduced Survival. Cancer Cell. 28 (6), 831-833 (2015).
  12. Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
  13. Stromnes, I. M., Hulbert, A., Pierce, R. H., Greenberg, P. D., Hingorani, S. R. T-cell Localization, Activation, and Clonal Expansion in Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 5 (11), 978-991 (2017).
  14. Morrison, A. H., Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. Immunotherapy and Prevention of Pancreatic Cancer. Trends in Cancer. 4 (6), 418-428 (2018).
  15. Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
  16. Yip-Schneider, M. T., et al. Dimethylaminoparthenolide and gemcitabine: a survival study using a genetically engineered mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 13, 194 (2013).
  17. Frese, K. K., et al. Nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer. Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).
  18. Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 28 (5), 638-652 (2015).
  19. Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. CD40 Stimulation Obviates Innate Sensors and Drives T Cell Immunity in Cancer. Cell Reports. 15 (12), 2719-2732 (2016).
  20. Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
  21. Keenan, B. P., et al. A Listeria vaccine and depletion of T-regulatory cells activate immunity against early stage pancreatic intraepithelial neoplasms and prolong survival of mice. Gastroenterology. 146 (7), 1784-1794 (2014).
  22. Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
  23. Maddipati, R., Stanger, B. Z. Pancreatic Cancer Metastases Harbor Evidence of Polyclonality. Cancer Discovery. 5 (10), 1086-1097 (2015).
  24. Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (18), (2018).
  25. Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), (2010).
  26. Stuelten, C. H., et al. Acute Wounds Accelerate Tumorigenesis by a T Cell-Dependent Mechanism. Cancer Research. 68 (18), (2008).
  27. Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods of Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
  28. Moreno, J. A., Sanchez, A., Hoffman, R. M., Nur, S., Lambros, M. P. Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  29. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
  30. Huynh, A. S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound-guided injection of cells. Public Library of Science One. 6 (5), e20330 (2011).
  31. Thomas, T. T., et al. Utilization of Ultrasound-guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  32. Jager, W., et al. Minimally invasive establishment of murine orthotopic bladder xenografts. Journal of Visualized Experiments. (84), e51123 (2014).
  33. Aiello, N. M., Rhim, A. D., Stanger, B. Z. . Orthotopic injection of pancreatic cancer cells. , (2016).

Tags

Ultrasound-guidedOrthotopic ImplantationMurinePancreatic Ductal AdenocarcinomaTumor Cell InjectionHigh ThroughputImmuno-oncologyCancer BiologyPancreatic FunctionDiabetesReal-time ImagingAnesthesiaDepilatory CreamTransverse Abdominal Image

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hay, C. A., Sor, R., Flowers, A. J., Clendenin, C., Byrne, K. T. Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. J. Vis. Exp. (153), e60497, doi:10.3791/60497 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image