Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Karolin Bomhardt; Pascal Schneider; Andr&#233; Portz; Christoph  R. Gebhardt; Michael D&#252;rr

doi:10.3791/60487

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

Анализ сложных молекул и их реакций на поверхности с помощью кластерной индуцированной дезорпации/ионизации масс-спектрометрии

Published: March 01, 2020

doi:

10.3791/60487

Karolin Bomhardt*¹, Pascal Schneider*¹, André Portz¹, Christoph R. Gebhardt², Michael Dürr¹

¹Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa),Justus Liebig University Giessen, ²Bruker Daltonik GmbH

Summary

_{Нейтральные} so 2 кластеры низкой кинетической энергии (злт; 0,8 эВ/компонент) используются для десорбных сложных молекул поверхности, таких как пептиды или липиды для дальнейшего анализа с помощью масс-спектрометрии с помощью спектромера массы ионной ловушки. Специальная подготовка образца не требуется, и наблюдение реакций в режиме реального времени возможно.

Abstract

Дезорпация/ионизация, индуцированная нейтральными кластерами SO₂ (DINeC), используется в качестве очень мягкого и эффективного метода дезорпирования/ионизации для масс-спектрометрии (МС) сложных молекул и их реакций на поверхности. DINeC основан на пучке скоплений SO_2, влияющих на поверхность образца при низкой энергии кластера. Во время столкновения с поверхностью кластера некоторые молекулы поверхности высвобождаются и ионизируются путем дисрастворимыввого кластера; в результате этого механизма дезрастворимых опосредований достаточно низкой энергии кластера и процесс обезвоживания чрезвычайно мягкий. Можно проанализировать как поверхностные адсорбаты, так и молекулы, из которых состоит поверхность. Получаются четкие и свободные от фрагментации спектры из сложных молекул, таких как пептиды и белки. DINeC не требует специальной подготовки образца, в частности, не матрицы должны быть применены. Метод дает количественную информацию о составе образцов; молекулы на поверхностном покрытии до 0,1% монослой могут быть обнаружены. Поверхностные реакции, такие как обмен H/D или термическое разложение, можно наблюдать в режиме реального времени, и можно вывести кинетику реакций. Используя импульсное сопло для генерации кластерных лучей, DINeC можно эффективно сочетать с масс-спектрометрией ионных ловушек. Матричная и мягкая природа процесса DINeC в сочетании с возможностями MSⁿ ионной ловушки позволяет очень детально и недвусмысленно анализировать химический состав сложных органических образцов и органических адсорбатов на поверхностях.

Introduction

Методы анализа чувствительных к поверхности часто основаны на зондах частиц, таких как низкоэнергетические электроны, атомы или ионы, которые сильно взаимодействуют с твердыми образцами. Как следствие, они показывают высокую чувствительность поверхности и подробную информацию о структуре поверхности могут быть получены¹. Химическая информация, однако, часто ограничена. Например, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия может дать количественную информацию об атомном составе и о средней химической среде данного вида (например, атомы углерода в органической молекуле, адсорбированной на поверхности^2). Однако с помощью стандартных методов анализа поверхности трудно получить более подробную информацию о сложных молекулах, связанных с поверхностью, таких, как их подробная структура или места связывания. С другой стороны, потребность в такой информации растет с ростом интереса к функционализации поверхности с помощью органических молекул. Расширяющиеся поля синтеза поверхности³ или поверхностной функционализации путем крепления биомолекул^4,⁵ являются двумя яркими примерами. Во всех этих областях изучаются фундаментальные вопросы по взаимодействию субстрата-адсорбата и адсорбатаи и адсорбатора, с тем чтобы лучше понять системы. Для этих исследований желательно получить максимальную информацию о молекулах адсорбаторов.

В частности, такая информация может дать вторичный ионный масс-спектрометрия (SIMS). Во-первых, SIMS очень чувствителен к поверхности. Во-вторых, по мере обнаружения распыленных адсорбаторов и их фрагментов с помощью MS получается информация, выходящим далеко за рамки атомного состава. В зависимости от характера химических видов адсорбированных на поверхности, он может быть идентифицирован по его молекулярной массы и фрагмент азорной картины наблюдается в масс-спектре⁶. Фрагменты, индуцированные первичными ионами, действительно могут помочь в идентификации исследуемого материала. С другой стороны, если первично-ионная индуцированная модификация (фрагментация, ионно-индуцированные реакции, смешивание) образца слишком сильна, большая часть информации об исходном состоянии образца теряется. Таким образом, были предприняты значительные усилия по сокращению фрагментации в SIMS (например, использование заряженных молекулярных кластеров в качестве первичных ионов^7,^8,^9). Тем не менее, фрагментация по-прежнему доминирует SIMS спектров крупных макромолекулов и биологических образцов^10,ограничивая применение SIMS в различных областях.

В качестве альтернативы мы показали, что десорбция/ионизация, индуцированная нейтральными кластерами (DINeC), является мягким и без матричного методом ионизации, который успешно применяется для масс-спектрометрического анализа сложных молекул^11,^12,^13,^14,^15,¹⁶^,¹⁷. DINeC основан на пучке молекулярных скоплений, которые состоят из 10³ до 10⁴ молекул SO₂ (рисунок 1). Когда кластеры влияют на образец, они по-разному взаимодействуют с молекулами на поверхности и на поверхности: во-первых, часть кинетической энергии кластера перераспределяется и активирует десегрегацию. Аналогичным образом важно, desorbing молекула растворяется в кластере во время столкновения кластера поверхности¹¹^,¹⁸^,¹⁹ (Рисунок 1 и Рисунок 2). Другими словами, на основе высокого диполивого момента SO_2,кластеры очень эффективно служат переходной матрицей для полярных аналитов. В результате, денормация молекул аналита происходит при кластерных энергиях в размере 1 эВ/молекулы и ниже. Мягкий характер процесса обезборки в дальнейшем поддерживается быстрым охлаждением системы, когда скопление SO₂ разрушается во время и после поверхностного удара¹¹^,¹⁹. Как следствие этих различных аспектов, кластер-индуцированной desorption сложных молекул, таких как пептиды, белки, липиды, и красители продолжается без какой-либо фрагментации desorbing молекул¹¹^,¹⁵; типичные масс-спектры показывают доминирующий пик при значении м/з нетронутой молекулы (МЗХ) или «М-Х»^– рисунок 3). В зависимости от количества и характера функциональных групп в молекуле, несколько заряженных катионов формы «M » n ^H’n’ наблюдаются¹¹^,¹⁵^,¹⁸. Для биомолекул, ионизация обычно происходит через поглощение или абстракцию протона в основной или кислой функциональной группы, соответственно¹¹. Если молекулы воды присутствуют в образце, то молекулы SO₂ из кластера могут вспоивать с этими молекулами воды образуя сернистые кислоты^18. Последний может выступать в качестве эффективного источника протона, который способствует процессу ионизации в случае ионизации через протонное поглощение (позитивный ионный режим)¹³^,¹⁸.

Рисунок 1: Схематическая иллюстрация кластерной десорбции/ионизации и экспериментальной настройки. Кластерная дезорпация/ионизация осуществляется в высоковакуумном сосуде. Луч скоплений SO₂ (желтые точки) производится с помощью сверхзвукового расширения газовой смеси SO₂/He из импульсного сопла. При столкновении с поверхностной поверхностью молекулы поверхности дезорируются и ионизируются. Молекулярные ионы (красные/оранжевые точки) передаются через предвзятую сетку, двойную ионную воронку и осьборовые ионные направляющие в ионную ловушку для масс-спектрометрии. Типичные масс-спектры показывают доминирующие пики на значениях м/з нетронутых молекул, здесь: M1 (оранжевый) и M2 (красный) в положительном ионном режиме. Взрыв: Во время столкновения с поверхностью кластера молекулы, выдающиеся, растворяются в ударном скоплении или одном из его фрагментов. Дальнейшее разрушение и испарение молекул SO₂ затем приводят к голой, нетронутой молекулярной ионности, обнаруженной в масс-спектрометре. Смотрите также Рисунок 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Снимки моделирования молекулярной динамики, иллюстрирующие кластерное десорбцию через рассечение. (A) скопление SO₂ (300 молекул) приближается к поверхности с перпендикулярно 1250 м/с к поверхности, на которой адсорбируется дипептид (аспарговый кислотно-аргинин, ASP-ARG). (B) При столкновении с кластерной поверхностью скопление разрушается. Адсорбированный дипептид взаимодействует с окружающими молекулами SO_2, что приводит к его рассеиванию в одном из фрагментов скопления. (C) Фрагменты кластера отталкиваются от поверхности. Помеченный фрагмент (синий круг) несет дипептид, который высвобопена в этом фрагменте. Эта цифра была изменена с ссылки 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Представительный массовый спектр и молекулярная модель ангиотензина II. (A) Масс-спектра (верхняя панель: положительный ионный режим, нижняя панель: отрицательный ионный режим), полученный после кластерного опреснения/ионизации из образца ангиотензина II. Образец был подготовлен путем отливки соответствующего раствора на Si (покрытой его естественным оксидом). Основные пики присваиваются нетронутой биомолекуле, «МЗХ» и «М-Х»^–; никаких фрагментационных моделей не наблюдается. Димерс (2МЗЗ, стрелка) далее указывает на мягкий характер процесса обезвожда. Положительный ионный сигнал более интенсивный из-за влияния скоплений SO₂ ^18. (B) Космическая модель и аминокислотная последовательность ангиотензина II. Белые шары указывают на атомы водорода; черный: углерод; синий: азот; красный: кислород. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

DINeC может быть применен к любому типу твердого образца, который совместим с высоким вакуумом условиях. Никакой специальной подготовки образца не требуется, в частности, не матрицы должны быть применены до DINeC-MS измерений, в отличие от матричной лазерной дезорпации / ионизации (MALDI) масс-спектрометрии и связанных с ними методов²⁰^,²¹. Это позволяет в режиме реального времени измерять химические изменения образца с различными экспериментальными условиями, такими как фоновое давление реактивных видов в вакуумной камере²² или температуру образца. Было показано, что предел обнаружения DINeC-MS в диапазоне^11. При применении к анализу биомолекул, адсорбированных на твердых поверхностях в подмонослойном режиме, поверхностное покрытие до 0,1% монослойа было обнаружено^23. В этом режиме покрытия интенсивность сигнала линейно зависит от покрытия поверхности, и DINeC-MS может быть использован для количественного анализа состава поверхности^23. В случае смешанных образцов, количественную оценку состава образца возможно¹⁷^,²⁴, как никакого существенного влияния химической среды на вероятность ионизации наблюдается (например, в случае смешанных липидов / пептид ных есть^{образцы 17}). Это явно контрастирует с SIMS, для которой вероятность ионизации данного вида, как правило, сильно зависит от присутствия различных химических компонентов (так называемый “матричной эффект”²⁵^,²⁶).

В дополнение к анализу поверхности, химический состав в подповерхностной области может быть исследован с помощью глубины профилирования¹⁷. При нынешней настройке типичные показатели десорбции кластерно-индуцированного desorption биомолекул имеют порядка 10^-3 нм/с. Высокое разрешение глубины в диапазоне от 1 до 2 нм наблюдается для смешанных липидов / пептидных образцов¹⁷.

Еще одним полем применения является сочетание DINeC-MS с тонкой слою хроматографии (TLC). Обычные пластины TLC могут быть непосредственно проанализированы с помощью DINeC-MS. Позиция-зависимых масс-спектров могут быть приобретены из TLC пластин и, таким образом, масс-специфические хроматограммы могут быть получены из TLC пластин²⁷. Нет повторного удаления разделенных анализов не требуется, отличается от TLC в сочетании с ESI²⁸^,²⁹. Для комбинации DINeC-MS и TLC также не требуется матрица, в отличие от соединения TLC с MALDI²⁸^,²⁹.

Ионизация электроспрея (DESI) также является методом мягкого дезорпирования/ионизации для MS-приложений³⁰^,³¹. Наиболее поразительными различиями между DINeC и DESI являются: количественный характер DINeC^23,его совместимость с ультра-высоким вакуумом (UHV) условиях, в частности возможность исследовать образцы, подготовленные и переданные в условиях UHV, не нарушая вакуум²³, а также возможность эффективно десорб неполярных молекул¹⁹.

В принципе, DINeC как источник дезорпации/ионизации может быть соединен с любым типом масс-спектрометра. Однако сочетание с масс-спектрометрией ионных ловушек имеет два основных преимущества: во-первых, ширина импульса и скорость повторения типичного импульсного кластерного луча очень хорошо соответствуют прерывосному времени накопления, а также спектральной скорости ионной ловушки¹⁵^,³². Во-вторых, мягкая природа процесса DINeC приводит к обезумению нетронутых молекул. В сочетании с возможностями MSⁿ ионной ловушки масс-спектрометрии, это позволяет наиболее полный анализ исследованных образцов¹⁵.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен в любое время. 1. Подготовка субстратов Для стандартных образцов вырежьте субстраты из кремниевых пластин (толщина около 0,5 до 1 мм) на кусочки 1 х 1 см2. Очистите субстраты Si в ультразвуковой ванне с этанолом и ацетоном по 15 мин каждый. Высушите субстраты в потоке сухого азотного газа. 2. Подготовка образцов Стандартная подготовка образца Для стандартных образцов, подготовить раствор, содержащий молекулы анализируя в соответствии с научным вопросом, который будет рассмотрен. Концентрация аналитика должна быть не менее 1 х 10-10 мол/л. Капля-литый от 5 до 30 л образца раствора на подстрате. В зависимости от давления пара растворителя, дайте образцу высохнуть в условиях окружающей среды или в сушилке до тех пор, пока не испариться весь растворитель и не образуется сухая пленка. В зависимости от количества применяемых веществ толщина пленки может составлять от нескольких десяти мкм (возможны визуальный осмотр) и монослойный режим субмонослой (таким образом, не обнаруживаемый глазом). Смонтировать образцы на держатель образца (например, используя липкую ленту или зажимы, затянутые винтами, в зависимости от необходимых образцов и вакуумных условий). Если возможно, дополнительно смонтировать эталонный образец, такой как микрометровая пленка ангиотензина II, на держателе образца. Альтернативный отбор образцов Используйте альтернативные схемы подготовки образцов, такие как осаждение электроспрейи ионного луча (ES-IBD) в вакуумном или опускном покрытии в соответствующем растворе, если это применимо. Монтаж образцов, которые должны быть подготовлены и переданы в вакууме на DINeC образца держателя до подготовки этапов. Убедитесь, что образцы с окунаемыми высохнут после заключительного шага подготовки. Рассмотрим простейшие схемы подготовки. В качестве примера, для исследования чернил маркера, просто нарисуйте точку на поверхности субстрата. 3. Передача образцов в масс-спектрометр DINeC Передача проб из окружающей среды в эвакуированную камеру DINeC Вент системы блокировки груза. Откройте нагрузочный замок и установите держатель образца. Закройте нагрузочный замок и нагните камеру блокировки груза до давления ниже 2 х 10-5 мбар. Откройте клапан в камеру DINeC и перенесите держатель образца с переносным стержнем на основной манипулятор. Прикрепите держатель образца к манипулятору. Отвратите переносной стержень и закройте клапан между погрузчиком и камерой DINeC. Передача образцов из вакуума в эвакуированную камеру DINeC Используйте переносимый вакуумный контейнер, который может быть прикреплен к флангу CF40 камеры DINeC. Передача образцов, которые были подготовлены в вакууме, с этим контейнером, не нарушая вакуума. Убедитесь, что образцы установлены на выборочном держателе, совместимом с манипулятором, используемым в системе DINeC. Прикрепите переносимый вакуумный контейнер к флангу CF40 и снимите громкость между контейнером и камерой DINeC. После того, как давление упало ниже 2 х 10-5 мбар, откройте клапаны ворот к камере DINeC и переносимый вакуумный контейнер и перенесите образец в камеру DINeC на манипулятор с помощью колеблющихся палок или другой системы передачи с более чем 50 см линейным движением. Отречить систему передачи и закрыть два клапана ворот. 4. Подготовка газовой смеси Подготовьте смесь около 3% SO2 в гелии, сначала эвакуировав газовые баллоны системы смешивания газа в течение 10 мин. Заполните цилиндры SO2 до достижения давления 1 бар. Далее заполняйте цилиндры гелием до достижения общего давления в 30 бар.ВНИМАНИЕ: При использовании SO2, соответствующие меры предосторожности, такие как хранение SO2 цилиндров в назначенных газовых шкафах всегда должны быть выполнены. 5. Подготовка масс-спектрометра DINeC Откройте клапан между газовым баллоном и соплом. Отрегулируйте давление so2/He газовой смеси на контуре системы смешивания газа до 15 бар. Установите положение манипулятора в положение эталонного образца. Для измерения катионных масс-спектров установите смещение выборки и сетки до 40 и 7 В соответственно. Для привода импульсного сопла и ионной ловушки масс-спектрометра установите генератор внешней функции до 2 Гц. С генератором задержки, установите задержку времени nмежду сигналом ясной ловушки от ловушки иона и сигналом триггера для импульсного сопла до 5 ms. В программном обеспечении управления, настроить следующие параметры, нажав соответствующие кнопки или набрав соответствующие значения в режиме страницы основного окна диалога: Режим сканирования: Увеличенное разрешение, Диапазон: м / z 50 – 3000, Accu-время: 0.1 ms, Средний: 10 циклов, Полярность: положительный для измерения катицианского спектраПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения анионных спектров, выборка и смещения сетки должны быть отрицательными по отношению к земле, Polarity должна быть переключена на Негатив в программном обеспечении управления. 6. Измерение масс-спектров После того, как давление ниже 3 х 10-6 мбар был достигнут в камере DINeC, измерение может быть начато. Начните измерение, сначала нажав Stand by, а затем нажав Operate в программном обеспечении управления. Начните запись измерений, нажимая на кнопку Воспроизведения. Измерьте испытательный спектр из эталонного образца, такого как ангиотензин II около 300 с. Следуйте временной зависимости сигнала, используя набор хроматограммы к соответствующему значению м/з. Оптимизируйте интенсивность сигнала путем корректировки задержки времени между сигналом Clear trap и сигналом, запускающим импульсное сопло. Переместите манипулятор в положение образца для измерения. Оптимизируйте интенсивность сигнала путем корректировки положения образца в плоскости держателя образца. Приобретайте масс-спектры в течение периода времени интереса. Изменение экспериментальных параметров, таких как температура образца или фоновое давление в камере в соответствии с деталями эксперимента. Продолжайте принимать масс-спектры при изменении экспериментальных параметров. 7. Оценка данных После завершения измерения загрузите соответствующий набор данных в программу анализа данных. Выберите период времени интереса к хроматограмме с правой кнопкой мыши. Усредненный спектр будет отображаться в отдельном окне. Экспорт спектра в качестве файла данных для дальнейшей обработки в программе выбора.

Representative Results

В следующем приводится два примера применения DINeC-MS в режиме реального времени. На рисунке 4 показано изменение массового спектра, полученного от ангиотензина II при нагревании образца до приблизительно 140 градусов по Цельсию. Когда конечная температура достигается(рисунок 4B, Рисунок 4E), спектр характеризуется дополнительным пиком, указывающим на потерю Сущности H2O(м/з 1029). При сохранении образца при такой температуре наблюдается дальнейшее разложение молекул ангиотензина II(рисунок 4С),включая потерю одного из узловых аминокислотных единиц, аспарагиновой кислоты (пик на м/з – 932, рисунок 4D). Количественный анализ данных позволяет оценить основную реакцию кинетики(рисунок 4E). В частности, на рисунке 4E показано, что сущность с м/з no 1029 является промежуточным, который далее разлагается на более мелкие фрагменты по мере увеличения интенсивности, а затем уменьшения. Сопутствующей константы курса, таким образом, находятся в том же порядке величины. В качестве второго примера, исследование водорода / дейтерия обмена в ангиотензин II22 иллюстрируется на рисунке 5. При воздействии образца ангиотензина на D2O в камере DINeC (pD2O – 10-4 мбар), изотопный узор ангиотензина II расширяется и смещается в сторону более высоких значений м/з, указывающих на обмен H атомами D. Процесс происходит быстро в течение первых 60 с, но значительно замедляется в дальнейшем ходе эксперимента: изотопный рисунок на рисунке 5B охватывает широкий диапазон м/з (приблизительно 15 м/з). Когда мы определяем степень дейтерации d как количество обменянных атомов H в молекуле, значения d от d q 0 до d 13 можно извлечь из спектра. На рисунке 5Cизотопный рисунок снова уменьшается в ширину. Это наблюдение можно объяснить сильно сниженной интенсивностью пиков, которые связаны с самыми низкими градусами дейтерации. На рисунке 5Dспектр показан еще дольше. Диапазон покрытых м/з остается почти таким же, но центр массы спектра по-прежнему медленно смещается в сторону возрастающих значений м/з. Для длительного времени воздействия, часть молекул достигает высшей степени deuteration, dmax No 17. Он соответствует максимальному количеству обмениваемых атомов H, учитываемому количеством атомов H, связанных с функциональными группами, такими как карбоксиловые кислоты или группы амина. Уже от височной эволюции спектра, можно вывести что обмен H/D осуществляет с по-разному константами тарифа. Для количественного описания этого наблюдения средняя степень deuteration d’ построена на рисунке 5E как функция времени. Инспекция экспериментальных результатов (символов) показывает три различных режима: быстрое увеличение d’operative для т t lt; 50 s, промежуточный режим для 50 s lt; t t; 200 s, и медленное, но почти непрерывное увеличение для т Экспериментальные результаты были смоделированы с помощью моделирования Монте-Карло; псевдо-первый порядок реакции кинетики с реакцией константы kя были предположены, для обмена H/D в функциональных группах молекулисследовали 22. Хорошее соглашение между моделированием и экспериментальными результатами во всех трех режимах было получено только тогда, когда применялись по крайней мере три различные константы курса ki для обмена H/D в молекулах ангиотензина II. На рисунке 5F,G, кинетика, выведенная из установки экспериментальных моделей изотопа по сумме изотопных узоров для разной степени deuteration (Рисунок 5A к рисунку 5D) показаны. Четко соблюдается хорошее соглашение между экспериментальными данными и моделированием, а также весьма различные обменные курсы для низких и высоких степеней дейтерации. По сравнению с различными олигопептидами, такими как гексаглицин, быстрые обменные курсы были отнесены к явным функциональным группам, в то время как медленные обменные курсы были связаны с группами амида позвоночника пептида22. В то время как эти первые два примера были измерены с микрометровой толщиной ангиотензина II образцов, Рисунок 6 показывает результаты, полученные из субмонослой покрытия ангиотензина II на образцах золота, подготовленных с помощью электроспрей ионного луча осаждения (ES-IBD)23. Линейная зависимость интенсивности сигнала от количества вещества наблюдается более чем на 3 порядка величины, наименьшее количество обнаруженного вещества соответствует 0,1% монослой молекул ангиотензина II на поверхности золота. H / D обмен эксперименты, как показано на рисунке 5 были также выполнены с ангиотензина II на золото в подмонослойном режиме23. Рисунок 4: Наблюдение в режиме реального времени за термической деградацией ангиотензина II. (A-C) Масс-спектры, полученные после кластерной индуцированной дезорпации/ионизации из образца ангиотензина II. (A) Свежий образец на RT. (B) Образец нагревается до приблизительно 140 градусов по Цельсию. В дополнение к пику на м/з 1047, который связан снетронутой молекулой «МЗХ», пики на м/з 932, 1012 и 1029 появляются (указанные стрелками). (C) Последние пики увеличиваются, а основной пик уменьшается со временем при сохранении образца при повышенной температуре. (D) Структурная формула ангиотензина II с указанием фрагмента (коричневые скобки), что приводит к появлению пика на м /з No 932 в результате потери одного аминокислотного блока (аспарагиновой кислоты). (E) Зависимость от времени температуры образца и интенсивности основных пиков, указанных на участках (A) к (C). Твердые линии являются проводниками к глазу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Наблюдение в режиме реального времени за обменом H/D в ангиотензине II. (A-D) Киционистские масс-спектры ангиотензина II, полученные с помощью DINeC-MS. Благодаря обмену H/D, изотопный узор расширяется и смещается в сторону более высоких значений м/з в (B) в (D) по сравнению с изотопной моделью недейных видов, показанных в (A). Красные линии являются данными, пунктирные линии циана подходят к данным с учетом различных степеней дейтерации. (E) Средняя степень deuteration d’ как функция времени, выведенного из экспериментов (открытые точки). Кроме того, показано дежавю как функцию времени, выведенного с помощью моделирования Монте-Карло. Черная кривая: моделирование с учетом одной постоянной скорости(k1); красная кривая: с учетом трех констант(к1, к2, k3). (F,G) Относительная интенсивность сигнала выбранных степеней deuteration ангиотензина II (символы и твердые линии) в качестве функции времени вместе с соответствующими результатами моделирования Монте-Карло (разбитые линии). Эта цифра была изменена с ссылки 22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 6: Применение DINeC-MS к ангиотензину II на золоте в подмонослойном режиме. (A) Схематическое представление комбинации ES-IBD для осаждения и DINeC-MS для масс-спектрометрии изолированных молекул ангиотензина II в подмонослойном режиме. (B) зависимость интенсивности сигнала от количества вещества, отложенного в образце, полученного из двух независимых наборов данных (заполненных и открытых символов). Вставки: mass spectra DINeC, полученные из образцов, на которых было отложено количество вещества, как указано. Эта цифра была изменена со ссылки 23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Во многих исследованиях, проведенных до сих пор, была продемонстрирована высокая чувствительность DINeC-MS к различным веществам. Действительно, это позволяет измерения анализов до количества вещества в фемтомоле режим^{е 11}. Из-за этой высокой чувствительности, подготовка образца, в частности очистка субстрата, должна быть выполнена с высоко чистыми химическими веществами, чтобы избежать загрязнения в масс-спектрах DINeC. Как и во многих методах анализа, надлежащее измерение фона из пустого субстрата помогает отделить пики от анализа и пиков, которые имеют свое происхождение в субстрате/подготовке образца.

Хотя мы показали, что вероятность ионизации данной молекулы анализней не сильно зависит от присутствия коадсорббатов или со-компонентов в смешанных образцах^17,²⁴, вероятность ионизации может варьироваться от вещества до вещества¹³. Таким образом, еще более важно работать в чистых условиях, поскольку загрязняющие вещества, в зависимости от вероятности их ионизации, могут способствовать сигналу гораздо сильнее, чем анализ. Предварительно сформированные ионы (например, как в случае многих молекул красителя), или молекулы с функциональными группами, которые показывают явную тенденцию к поглощению или депротонации протона (т.е. основания или кислоты), как правило, показывают высокую вероятность ионизации в DINeC-MS. Если такая функциональная группа не присутствует в аналите, вероятность ионизации может быть низкой. Образцы затем могут рассматриваться ионизирующими агентами, такими как трифторная кислота (например, путем воздействия образца на давление пара ионизирующего агента).

Репрезентативные результаты, обсуждаемые на рисунке 4 и рисунке 5, свидетельствуют о применимости DINeC-MS для проведения исследований химических реакций в режиме реального времени с помощью масс-спектрометрии. На рисунке 6 иллюстрируется субмонослойная чувствительность метода. Если два свойства объединены, химические реакции на поверхностях и их продукты могут следовать в режиме реального времени²³. Это может представлять особый интерес для так называемого «синтеза на поверхности», который приводит к сборке макромолекулярных структур на поверхностях^3,^33,^34,^35,³⁶. В текущей настройке наблюдение таких поверхностных реакций возможно на поверхностях с более низкой реактивностью, таких как золото²³ и другие благородные металлы; эксперименты труднее проводить на высокореактивных поверхностях, таких как кремниевые поверхности^37,так как базовое давление в камере desorption находится в диапазоне 10^-7-mbar. Текущая деятельность направлена на устранение этого ограничения, и в настоящее время наращеется аппарат DINeC, совместимый с UHV. В случае реактивных поверхностей взаимодействие между SO₂ и поверхностью субстрата должно быть проверено до измерения поверхностных адсорбаторов и поверхностных реакций.

Поскольку луч кластера является нейтральным, он не может быть сфокусирован. Таким образом, размер луча на образце определяется геометрией установки и гумификатором в используемом скиммере; типичные значения для диаметра луча на образце от одного до нескольких миллиметров. В результате визуализация путем сканирования образца возможна только с очень низким разрешением. С другой стороны, учитывая высокую вероятность ионизации¹³, DINeC эффективно использует desorbed молекул. Таким образом, сочетание DINeC-MS и детектора ионных изображений³⁸ представляется весьма привлекательным.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают финансовую поддержку со стороны Международного центра АФИР имени Гельмгольца (HICforFAIR) и Высшей школы хадронов и ионов имени Гельмгольца (P.S.). Авторы благодарят профессора Раушенбаха (Оксфордский университет) и его команду за плодотворное сотрудничество в комбинированных экспериментах ES-IBD/DINeC.

Materials

Acetone rotisolv HPLC	Roth	7328.2	HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC	Roth	p076.1	HPLC Gradient Grade
Helium	Praxair	4800086706	Purity 99.9999%
Nitrogen	Praxair	40728408	Purity 99.5 – 100%
Silicon Wafers	Active Business Company GmbH	G60007
Sulfur dioxide	Air Liquide	P1734S10R0A001	Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS	Roth	HN43.1	Ultra LC-MS

References

Vickerman, J. C., Gilmore, I. . Surface Analysis: The Principal Techniques. , (2009).
Reutzel, M., Münster, N., Lipponer, M. A., Länger, C., Höfer, U., Koert, U., Dürr, M. Chemoselective Reactivity of Bifunctional Cyclooctynes on Si(001). Journal of Physical Chemistry C. 120, 26284-26289 (2016).
Grill, L., Dyer, M., Lafferentz, L., Persson, M., Peters, M., Hecht, S. Nano-architectures by covalent assembly of molecular building blocks. Nature Nanotechnol. 2, 687-691 (2007).
Stutzmann, M., Garrido, J. A., Eickhoff, M., Brandt, M. S. Direct biofunctionalization of semiconductors: A survey. Physica Status Solidi A. 203, 3424-3437 (2006).
Adler-Abramovich, L., Gazit, E. The physical properties of supramolecular peptide assemblies: from building block association to technological applications. Chemical Society Reviews. 43, 6881-6893 (2014).
Vickerman, J. C., Briggs, D. . TOF-SIMS: Materials Analysis by Mass Spectrometry, 2nd ed. , (2013).
Winograd, N. The magic of cluster SIMS. Analytical Chemistry. 77, 142-149 (2005).
Ichiki, K., Ninomiya, S., Nakata, Y., Honda, Y., Seki, T., Aoki, T., Matsuo, J. High Sputtering Yields of Organic Compounds by Large Gas Cluster Ions. Applied Surface Science. 255, 1148-1150 (2008).
Mochiji, K., Hashinokuchi, M., Moritani, K., Toyoda, N. Matrix-free Detection of Intact Ions from Proteins in Argon-Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23, 648-652 (2009).
Yokoyama, Y., Aoyagi, S., Fujii, M., Matsuo, J., Fletcher, J. S., Lockyer, N. P., Vickerman, J. C., Passarelli, M. K., Havelund, R., Seah, M. P. Peptide Fragmentation and Surface Structural Analysis by Means of ToF-SIMS Using Large Cluster Ion Sources. Analytical Chemistry. 88, 3592-3597 (2016).
Gebhardt, C. R., Tomsic, A., Schröder, H., Durr, M., Kompa, K. L. Matrix-Free Formation of Gas-Phase Biomolecular Ions by Soft Cluster-Induced Desorption. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 4162-4165 (2009).
Baur, M., Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Durr, M. Soft Clusterinduced Desorption and Ionization of Biomolecules – Influence of Surface Load and Morphology on Desorption Efficiency. Applied Physics Letters. 99, 234103 (2011).
Lee, B. J., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Quantification of the Ionization Probability During Desorption/Ionization of Oligopeptides Induced by Neutral Cluster Impact. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 27, 1090-1094 (2013).
Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Schroder, H., Kompa, K. L., Durr, M. Observation of Ionic Desorption Channels in Cluster-induced Desorption of Alkali Halides – Influence of Surface Electronic Properties and Surface Configuration. Chemical Physics Letters. 556, 77-81 (2013).
Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact as a Soft and Efficient Ionization Source for Ion Trap Mass Spectrometry of Biomolecules. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28, 290-296 (2014).
Kley, C. S., Dette, C., Rinke, G., Patrick, C. E., Cechal, J., Jung, S. J., Baur, M., Durr, M., Rauschenbach, S., Giustino, F., Stepanow, S., Kern, K. Atomic-Scale Observation of Multiconformational Binding and Energy Level Alignment of Ruthenium-Based Photosensitizers on TiO2 Anatase. Nano Letters. 14, 563-569 (2014).
Portz, A., Aoyagi, S., Durr, M. Soft depth-profiling of mixed peptide/lipid samples by means of cluster induced desorption/ionization mass spectrometry – high depth resolution and low matrix effect. Biointerphases. 13, 03B405 (2018).
Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Frank, A. J., Neuderth, P., Eickhoff, M., Durr, M. Influence of the Cluster Constituents’ Reactivity on the Desorption/Ionization Process Induced by Neutral SO2 Clusters. Journal of Chemical Physics. 146, 134705 (2017).
Schneider, P., Durr, M. Cluster-induced desorption investigated by means of molecular dynamics simulations – Microsolvation in clusters of polar and non-polar constituents. Journal of Chemical Physics. 150, 214301 (2019).
Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10 000 Daltons. Analytical Chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90, 240-265 (2018).
Portz, A., Gebhardt, C. R., Durr, M. Real-Time Investigation of the H/D Exchange Kinetics of Porphyrins and Oligopeptides by Means of Neutral Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Journal of Physical Chemistry B. 121, 11031-11036 (2017).
Portz, A., Baur, M., Rinke, G., Abb, S., Rauschenbach, S., Kern, K., Dürr, M. Chemical Analysis of Complex Surface-Adsorbed Molecules and Their Reactions by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90, 3328 (2018).
Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Mass Spectrometry of Oligopeptides in the Presence of Large Amounts of Alkali Halides Using Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact. Biointerphases. 11, 02A316 (2016).
Shard, A. G., Spencer, S. J., Smith, S. A., Havelund, R., Gilmore, I. S. . International Journal of Mass Spectrometry. 377, 599-609 (2015).
Nakano, S., Yamagishi, T., Aoyagi, S., Portz, A., Durr, M., Iwai, H., Kawashima, T. Evaluation of Matrix Effects on TOF-SIMS Data of Leu-enkephalin and DOPC Mixed Samples. Biointerphases. 13, 03B403 (2018).
Heep, J., Tuchecker, P. H. K., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. ACS Omega. 4, 22426-22430 (2019).
Morlock, G., Schwack, W. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 29, 1157-1171 (2010).
Cheng, S. C., Huang, M. Z., Shiea, J. Thin layer chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218, 2700-2711 (2011).
Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306, 471 (2004).
Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science. 311, 1566 (2006).
Dürr, M., Gebhardt, C. Ion generation in mass spectrometers by cluster bombardment. US Patent. , (2019).
Lindner, R., Kuhnle, A. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. ChemPhysChem. 16, 1582-1592 (2015).
Dong, L., Liu, P. N., Lin, N. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. Accounts of Chemical Research. 48, 2765-2774 (2015).
Björk, J. Reaction mechanisms for on-surface synthesis of covalent nanostructures. Journal of Physics: Condensed Matter. 28, 083002 (2016).
Rauschenbach, S., Rinke, G., Gutzler, R., Abb, S., Albarghash, A., Le, D., Rahman, T. S., Durr, M., Harnau, L., Kern, K. Two-Dimensional Folding of Polypeptides into Molecular Nanostructures at Surfaces. ACS Nano. 11, 2420-2427 (2017).
Dürr, M., Höfer, U. Dissociative adsorption of molecular hydrogen on silicon surfaces. Surface Science Reports. 61, 465-526 (2006).
Zhang, J., Franzreb, K., Aksyonov, S. A., Williams, P. Mass Spectra and Yields of Intact Charged Biomolecules Ejected by Massive Cluster Impact for Bioimaging in a Time-of-Flight Secondary Ion Microscope. Analytical Chemistry. 87, 10779-10784 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Bomhardt, K., Schneider, P., Portz, A., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60487, doi:10.3791/60487 (2020).

Automatically Generated