Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Karolin Bomhardt; Pascal Schneider; Andr&#233; Portz; Christoph  R. Gebhardt; Michael D&#252;rr

doi:10.3791/60487

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Chemistry

Análise de Moléculas Complexas e Suas Reações em Superfícies por meio da espectrometria de desormetria/desonização induzida por cluster

Published: March 01, 2020

doi:

10.3791/60487

Karolin Bomhardt*¹, Pascal Schneider*¹, André Portz¹, Christoph R. Gebhardt², Michael Dürr¹

¹Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa),Justus Liebig University Giessen, ²Bruker Daltonik GmbH

Summary

Os clusters Neutro SO₂ de baixa energia cinética (< 0,8 eV/constituinte) são usados para desorba moléculas complexas de superfície, como peptídeos ou lipídios para análise posterior por meio de espectrometria de massa usando um espectrômetro de massa armadilha de íons. Não é necessária preparação especial de amostra, e a observação em tempo real das reações é possível.

Abstract

Desorcação/Ionização Induzida por Neutro SO₂ Clusters (DINeC) é empregada como uma técnica de desorpção/ionização muito macia e eficiente para espectrometria de massa (MS) de moléculas complexas e suas reações em superfícies. DiNeC é baseado em um feixe de aglomerados SO₂ impactando na superfície da amostra em baixa energia de cluster. Durante o impacto da superfície do cluster, algumas das moléculas de superfície são desorizadas e ionizadas via dissolução no aglomerado impactante; Como resultado deste mecanismo de desorpção mediado pela dissolução, a energia de baixo cluster é suficiente e o processo de desorpoção é extremamente suave. Tanto os adsorbates superficiais quanto moléculas dos quais a superfície é composta podem ser analisadas. Espectros claros e livres de fragmentação de moléculas complexas, como peptídeos e proteínas, são obtidos. O DINeC não requer qualquer preparação especial para amostra, em particular nenhuma matriz tem que ser aplicada. O método produz informações quantitativas sobre a composição das amostras; moléculas em uma cobertura superficial tão baixa quanto 0,1 % de um monocamada pode ser detectada. Reações superficiais como troca de H/D ou decomposição térmica podem ser observadas em tempo real e as cinéticas das reações podem ser deduzidas. Usando um bico pulsado para geração de feixe de cluster, o DINeC pode ser eficientemente combinado com espectrometria de massa de armadilha de íons. A natureza livre de matrizes e suave sem matriz do processo DINeC em combinação com as capacidades de MSⁿ da armadilha de íons permite uma análise muito detalhada e inequívoca da composição química de amostras orgânicas complexas e adsorbates orgânicos em superfícies.

Introduction

Técnicas de análise sensíveis à superfície são frequentemente baseadas em sondas de partículas, como elétrons de baixa energia, átomos ou íons que interagem fortemente com amostras sólidas. Como consequência, eles mostram que a alta sensibilidade à superfície e informações detalhadas sobre a estrutura da superfície podem ser obtidas¹. As informações químicas, no entanto, são muitas vezes limitadas. Como exemplo, a espectroscopia fotoeletrônica de raios-X pode dar informações quantitativas sobre a composição atômica e sobre o ambiente químico médio de uma determinada espécie (por exemplo, os átomos de carbono em uma molécula orgânica adsorbed em uma superfície²). No entanto, informações mais detalhadas sobre moléculas complexas e adsorladas à superfície, como sua estrutura detalhada ou locais de ligação, são difíceis de obter com técnicas padrão de análise de superfície. Por outro lado, a necessidade de tais informações está crescendo com o crescente interesse pela funcionalidade superficial por meio de moléculas orgânicas. Os campos em expansão da síntese on-superfície³ ou da funcionalidade superficial por conexão de biomoléculas^4,⁵ são dois exemplos proeminentes. Em todos esses campos, são investigadas questões fundamentais sobre interações de substrato-adsorbate e adsorbate-adsorbate são investigadas para entender melhor os sistemas. Para essas investigações, é desejável um máximo de informações sobre as moléculas adsorbedadas.

Em parte, a espectrometria de massa de íons secundários (SIMS) pode dar tais informações. Primeiro, o SIMS é altamente sensível à superfície. Em segundo lugar, à medida que os adsorbates e seus fragmentos são detectados por meio de Esms, informações muito além da composição atômica são obtidas. Dependendo da natureza das espécies químicas adsorciadas na superfície, ela pode ser identificada por sua massa molecular e padrão de fragmento observado no espectro de massa⁶. Os fragmentos induzidos pelos íons primários de fato podem ajudar na identificação do material analisado. Por outro lado, se a modificação induzida pelo íon primário (fragmentação, reações induzidas por íons, mistura) da amostra é muito forte, a maioria das informações sobre o estado original da amostra é perdida. Assim, grandes esforços têm sido realizados para reduzir a fragmentação no SIMS (por exemplo, utilizando clusters moleculares carregados como íons primários⁷^,⁸^,⁹). No entanto, a fragmentação ainda domina o espectro sims de grandes macromoléculas e amostras biológicas^10,limitando a aplicação do SIMS em diversos campos.

Como alternativa, mostramos a desorpição/ionização induzida por aglomerados neutros (DINeC) como um método de ionização suave e livre de matrizes que tem sido empregado com sucesso para análise espectrométrica em massa de moléculas complexas^11,¹²^,¹³^,¹⁴^,^15,¹⁶^,¹⁷. DiNeC é baseado em um feixe de aglomerados moleculares que consistem em 10³ a 10⁴ Moléculas SO₂ (Figura 1). Quando os clusters impactam na amostra, eles interagem de várias maneiras com as moléculas sobre e na superfície: primeiro, uma parte da energia cinética do cluster é redistribuída e ativa a desorcação. Da mesma forma importante, a molécula de sorbing é dissolvida no aglomerado durante o impacto da superfície do cluster¹¹^,¹⁸^,¹⁹ (Figura 1 e Figura 2). Em outras palavras, com base no momento de dipolo alto de SO_2,os aglomerados servem de forma muito eficiente como uma matriz transitória para análites polares. Como resultado, a desorcação das moléculas de analyte ocorre em energias de cluster tão baixas quanto 1 eV/molécula e abaixo. A natureza suave do processo de desorpoção é ainda mais apoiada pelo rápido resfriamento do sistema quando o aglomerado SO₂ se quebra durante e após o impacto da superfície¹¹^,¹⁹. Como consequência desses vários aspectos, a desorpoção induzida por cluster sorpção de moléculas complexas como peptídeos, proteínas, lipídios e corantes prossegue sem qualquer fragmentação das moléculas desorbing¹¹^,¹⁵; espectros típicos de massa mostram o pico dominante no valor m/z da molécula intacta ([M+H]⁺ ou [M-H]^–, Figura 3). Dependendo do número e natureza dos grupos funcionais na molécula, múltiplas coações carregadas da forma [M + n· H]ⁿ⁺ são observados¹¹^,^15,¹⁸. Para biomoléculas, a ionização normalmente ocorre por meio de captação ou abstração de um próton em um grupo funcional básico ou ácido, respectivamente¹¹. Se as moléculas de água estiverem presentes na amostra, as moléculas de Assim₂ do aglomerado podem reagir com essas moléculas de água formando ácido sulfúrico¹⁸. Este último pode atuar como uma fonte de próton eficiente que promove ainda mais o processo de ionização em caso de ionização via captação de prótons (modo íon positivo)¹³^,¹⁸.

Figura 1: Ilustração esquemática de desorção/ionização induzida por cluster e configuração experimental. A desorização/ionização induzida por cluster é realizada em um vaso de alto vácuo. Um feixe de clusters SO₂ (pontos amarelos) é produzido através da expansão supersônica de uma mistura de gás SO₂/He a partir de um bico pulsado. Durante o impacto da superfície do cluster, as moléculas de superfície são desorizadas e ionizadas. Íons moleculares (pontos vermelho/laranja) são transferidos através de uma grade tendenciosa, uma entrada de funil de íon duplo e guias de íons octopolares na armadilha de íons para espectrometria de massa. Espectros típicos de massa mostram picos dominantes nos valores m/z das moléculas intactas, aqui: M1 (laranja) e M2 (vermelho) no modo íon positivo. Exploda: Durante o impacto da superfície do cluster, as moléculas desorbedas são dissolvidas no aglomerado impactante ou em um de seus fragmentos. Despedaçando e evaporando de moléculas SO_2, então levam ao íon molecular intacto e nu como detectado no espectrômetro de massa. Veja também figura 2. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 2: Instantâneos de simulações de dinâmica molecular ilustrando a desorpção induzida por cluster via dissolução. (A) Um aglomerado SO₂ (300 moléculas) se aproxima da superfície com 1250 m/s perpendicular à superfície em que um dipeptídeo (ácido aspartico-arginina, ASP-ARG) é adsorlado. (B) Durante o impacto da superfície do cluster, o aglomerado se quebra. O dipeptídeo adsorlado interage com as moléculas SO₂ circundantes que levam à sua dissolução em um dos fragmentos de cluster. (C) Os fragmentos de aglomerados são repelidos da superfície. O fragmento rotulado (círculo azul) carrega o dipeptídeo que é desorlado neste fragmento. Este número foi modificado a partir da referência 19. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 3: Espectro de massa representativo e modelo molecular de angiotensin II. (A) Espectro de massa (painel superior: modo íon positivo, painel inferior: modo íon negativo) obtido após desorpção/ionização induzida por cluster de uma amostra angiotensin II. A amostra foi preparada por lançar a respectiva solução em um wafer Si (coberto por seu óxido natural). Os principais picos são atribuídos à biomolécula intacta, [M+H]⁺ e [M-H]^–; não são observados padrões de fragmentação. Dimers ([2M+H]^+,seta) indicam ainda a natureza macia do processo de desorcação. O sinal positivo de íon susoé mais intenso devido à influência dos aglomerados SO₂ ¹⁸. (B) Modelo de enchimento espacial e sequência de aminoácidos de angiotensin II. Bolas brancas indicam átomos de hidrogênio; preto: carbono; azul: nitrogênio; vermelho: oxigênio. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

O DINeC pode ser aplicado a qualquer tipo de amostra sólida compatível com condições de alto vácuo. Não é necessária preparação especial de amostra, em particular nenhuma matriz deve ser aplicada antes das medições DINeC-MS, em contraste com a espectrometria de massa de laser assistida por matrizes/ionria (MALDI) e técnicas relacionadas^20,²¹. Isso permite medições em tempo real de alterações químicas da amostra com diferentes condições experimentais, como pressão de fundo de espécies reativas na câmara de vácuo²² ou temperatura amostral. O limite de detecção do DINeC-MS tem se mostrado na faixa femtomole¹¹. Quando aplicada à análise de biomoléculas adsorizadas em superfícies sólidas no regime submonocamada, foi detectada uma cobertura superficial tão baixa quanto 0,1% de um monocamada²³. Neste regime de cobertura, a intensidade do sinal depende linearmente da cobertura superficial e o DINeC-MS pode ser usado para análise quantitativa da composição da superfície²³. No caso de amostras mistas, é possível uma avaliação quantitativa da composição amostral¹⁷^,²⁴, já que não se observa um efeito maior do ambiente químico sobre a probabilidade de ionização (por exemplo, no caso das amostras de lipídio/peptídeo misto¹⁷). Isso contrasta claramente com o SIMS, para o qual a probabilidade de ionização de uma determinada espécie é tipicamente fortemente influenciada pela presença de diferentes componentes químicos (o chamado “efeito matricial”²⁵^,²⁶).

Além da análise superficial, a composição química na região subsuperficial pode ser sondada por meio de perfil de profundidade¹⁷. Com a configuração atual, as taxas típicas de desorção de desorcação induzida por cluster de biomoléculas são da ordem de 10^-3 nm/s. Observou-se uma alta resolução de profundidade na faixa de 1 a 2 nm para amostras de lipídio/peptídeo^misto17.

Outro campo de aplicação é a combinação de DINeC-MS com cromatografia de camada fina (TLC). As placas TLC convencionais podem ser analisadas diretamente por meio do DINeC-MS. Os espectros de massa dependentes de posição podem ser adquiridos das placas TLC e, portanto, cromatogramas específicos de massa podem ser obtidos nas placas TLC²⁷. Não é necessário re-elusão dos analytes separados, diferente do TLC em combinação com ESI²⁸^,²⁹. Nenhuma matriz é necessária para a combinação DINeC-MS + TLC, em contraste com o acoplamento de TLC com MALDI²⁸^,²⁹.

A ionização de eletrospray de desorpção (DESI) também é um método de desorização/ionização suave para aplicações ms³⁰^,³¹. As diferenças mais marcantes entre DINeC e DESI são: a natureza quantitativa do DINeC²³, sua compatibilidade com condições ultra-alta vácuo (UHV), em particular a possibilidade de investigar amostras preparadas e transferidas em condições de UHV sem quebrar o vácuo^23,bem como a possibilidade de desorba eficientemente moléculas não polares¹⁹.

Em princípio, o DINeC como fonte de desorização/ionização pode ser acoplado a qualquer tipo de espectrômetro de massa. No entanto, a combinação com espectrometria de massa de armadilha de íons apresenta duas principais vantagens: primeiro, a largura de pulso e a taxa de repetição de um feixe típico de cluster pulsado correspondem muito bem ao tempo de acumulação descontínuo, bem como à taxa espectral da armadilha do íon¹⁵^,³². Em segundo lugar, a natureza suave do processo DINeC leva à desorcação de moléculas intactas. Em combinação com as^capacidades de Espectrometria em massa de armadilha de íons, isso permite uma análise mais abrangente das amostras investigadas¹⁵.

Protocol

NOTA: O protocolo pode ser pausado a qualquer momento. 1. Preparação de substratos Para amostras padrão, corte as substratas de wafers de silício (espessura de aproximadamente 0,5 a 1 mm) em pedaços de 1 x 1 cm2. Limpe os substratos do Si em um banho de ultrassom de etanol e acetona por 15 minutos cada. Seque os substratos em um fluxo de gás nitrogênio seco. 2. Preparação de amostras Preparação padrão da amostra Para amostras padrão, prepare a solução contendo as moléculas de analyte de acordo com a questão científica a ser abordada. A concentração do analyte deve ser pelo menos 1 x 10-10 mol/L. Drop-cast 5 a 30 μL da solução de amostra no substrato. Dependendo da pressão de vapor do solvente, deixe a amostra secar condições ambientais ou em um dessecador até que todo solvente tenha sido evaporado e uma película seca tenha sido formada. Dependendo da quantidade de substância aplicada, a espessura do filme pode ser entre vários dez μm (inspeção visual possível) e o monocamada ao regime submonocamada (portanto não detectável pelo olho). Monte as amostras no suporte da amostra (por exemplo, usando fita adesiva ou grampos apertados por parafusos, dependendo das amostras e condições de vácuo necessárias). Se possível, além disso, monte uma amostra de referência, como um filme de espessura de micrometro de angiotensin II, no suporte da amostra. Preparação alternativa de amostras Use esquemas alternativos de preparação de amostras, como deposição de feixe de íon son(ES-IBD) no vácuo ou revestimento de mergulho em uma respectiva solução, se aplicável. Monte amostras que devem ser preparadas e transferidas no vácuo no suporte de amostra DINeC antes das etapas de preparação. Certifique-se de que as amostras revestidas de mergulho estejam secas após a etapa final de preparação. Considere o esquema de preparação mais simples. Como exemplo, para a investigação da tinta de marcador, basta desenhar um ponto na superfície do substrato. 3. Transferência de amostras para espectrômetro de massa DINeC Transferência de amostras de condições ambientais para a câmara DINeC evacuada Amasse o sistema de bloqueio de carga. Abra a trava de carga e monte o suporte da amostra. Feche o bloqueio de carga e bombeie a câmara de bloqueio de carga para uma pressão abaixo de 2 x 10-5 mbar. Abra a válvula para a câmara DINeC e transfira o suporte de amostra com a haste de transferência para o manipulador principal. Conecte o suporte da amostra ao manipulador. Retraia a haste de transferência e feche a válvula entre o bloqueio de carga e a câmara DINeC. Transferência de amostras do vácuo para a câmara DINeC evacuada Use um recipiente de vácuo transportável, que pode ser anexado à flange CF40 da câmara DINeC. Transfira as amostras, que foram preparadas no vácuo, com este recipiente sem quebrar o vácuo. Certifique-se de que as amostras sejam montadas em um suporte de amostra compatível com o manipulador usado no sistema DINeC. Conecte o recipiente de vácuo transportável ao flange CF40 e bombeie o volume entre o contêiner e a câmara DINeC. Uma vez que a pressão caiu abaixo de 2 x 10-5 mbar, abra as válvulas do portão para a câmara DINeC e o recipiente de vácuo transportável e transfira a amostra para a câmara DINeC para o manipulador usando uma vara de oscilação ou outro sistema de transferência com mais de 50 cm de movimento linear. Retraia o sistema de transferência e feche as duas válvulas do portão. 4. Preparação da mistura de gás Prepare uma mistura de aproximadamente 3% SO2 em hélio, primeiro evacuando os cilindros de gás do sistema de mistura de gás por 10 min. Encha os cilindros com SO2 até que uma pressão de 1 barra seja alcançada. Encha ainda mais os cilindros com hélio até que uma pressão total de 30 barras seja alcançada.ATENÇÃO: Ao usar o SO2,as respectivas precauções de segurança, como armazenar cilindros SO2 em armários de gás designados, sempre devem ser cumpridas. 5. Preparação do espectrômetro de massa DINeC Abra a válvula entre o cilindro de gás e o bocal. Ajuste a pressão da mistura de gás SO2/Heno contorno do sistema de mistura de gás para 15 barras. Defina a posição do manipulador na posição da amostra de referência. Para medir espectros de massa cationic, defina o viés de amostra e grade para +40 e +7 V, respectivamente. Para conduzir o bocal pulsado e o espectrômetro de massa de armadilha de íons, coloque o gerador de função externa a 2 Hz. Com o gerador de atraso, ajuste o atraso de tempo Δtn entre o sinal de armadilha Clear da armadilha do íon e o sinal de gatilho para o bocal pulsado para 5 ms. No software de controle, ajuste os seguintes parâmetros pressionando os respectivos botões ou digitando os respectivos valores na página modo da janela de diálogo principal: Modo De varredura: Resolução aprimorada, Alcance: m/z 50 – 3000, Accu-time: 0,1 ms, Média: 10 ciclos, Polaridade: positivo para a medição de espectro de massa cationicNOTA: Para medir espectros aniônicos, a amostra e o viés da grade devem ser negativos em relação ao solo, a Polarity deve ser trocada para negativa no software de controle. 6. Medição de espectros de massa Uma vez que uma pressão abaixo de 3 x 10-6 mbar tenha sido alcançada na câmara DINeC, a medição pode ser iniciada. Inicie a medição primeiro pressionando Stand by e, em seguida, pressionando Operar no software de controle. Comece a gravar as medidas pressionando o botão Play. Meça um espectro de teste a partir de uma amostra de referência como angiotensin II por cerca de 300 s. Siga a dependência de tempo do sinal usando o Chromatogram definido para o respectivo valor m/z. Otimizar a intensidade do sinal através do ajuste do atraso de tempo Δtn entre o sinal de armadilha Clear e o sinal acionando o bico pulsado. Mova o manipulador para a posição da amostra a ser medida. Otimizar a intensidade do sinal através do ajuste da posição amostral dentro do plano de suporte de amostra. Aquisição de espectros de massa ao longo do período de juros. Modifique os parâmetros experimentais, como temperatura amostral ou pressão de fundo na câmara de acordo com os detalhes do experimento. Continue a tomar espectros de massa ao variar os parâmetros experimentais. 7. Avaliação de dados Após a análise da medição, carregue o respectivo conjunto de dados no programa de Análise de Dados. Selecione o tempo de interesse no cromatograma com o botão direito do mouse. O espectro médio será exibido em uma janela separada. Exporte o espectro como um arquivo de dados para processamento adicional em um programa de escolha.

Representative Results

A seguir, são apresentados dois exemplos para a aplicação em tempo real do DINeC-MS. A Figura 4 mostra a mudança do espectro de massa obtido a partir da angiotensin II quando a amostra é aquecida para aproximadamente 140 °C. Quando a temperatura final é atingida (Figura 4B, Figura 4E), o espectro é caracterizado por um pico adicional indicando a perda de uma entidade H2O (m/z = 1029). Ao manter a amostra a essa temperatura, observa-se uma maior decomposição das moléculas angiotensin II (Figura 4C), incluindo a perda de uma das unidades de aminoácidos terminais, ácido aspartico (pico de m/z = 932, Figura 4D). A análise quantitativa dos dados permite avaliar a cinética de reação subjacente(Figura 4E). Em particular, a Figura 4E demonstra que a entidade com m/z = 1029 é uma intermediária que se decompõe ainda mais em fragmentos menores à medida que a intensidade aumenta primeiro e depois diminui. As constantes de taxa concomitante estão, portanto, na mesma ordem de magnitude. Como segundo exemplo, a investigação da troca de hidrogênio/deutério na angiotensin II22 é ilustrada na Figura 5. Após a exposição da amostra de angiotensin a D2O na câmara DINeC (pD2O = 10-4 mbar), o padrão isotópico da angiotração II é ampliado e deslocado para valores mais elevados de m/z indicando troca de Átomos H por D. O processo é rápido durante os primeiros 60 s, mas diminui significativamente no curso do experimento: O padrão isótopo na Figura 5B cobre uma ampla gama de m/z (aproximadamente 15 unidades de 15 m/z). Quando definimos o grau de dedeu terceito d como o número de átomos H trocados em uma molécula, valores de d entre d = 0 a d = 13 podem ser extraídos do espectro. Na Figura5C,o padrão de isótopoé é novamente reduzido em largura. Esta observação pode ser atribuída à intensidade fortemente reduzida dos picos que estão associados aos menores graus de dedeu. Na Figura 5D,o espectro é mostrado para tempos de reação ainda mais longos. A faixa m/z coberta permanece quase a mesma, mas o centro de massa do espectro ainda muda lentamente para aumentar os valores de m/z. Para longos tempos de exposição, uma parte das moléculas atinge o maior grau de dedeu, dmax = 17. Corresponde ao número máximo de átomos H trocados, dado pelo número de átomos H ligados a grupos funcionais, como ácidos carboxílicos ou grupos de amina. Já a partir da evolução temporal do espectro, pode ser deduzido que a troca de H/D ocorre com diferentes constantes de taxas. Para uma descrição quantitativa desta observação, o grau médio de dedeuteration dédio é traçado na Figura 5E como função do tempo. A inspeção dos resultados experimentais (símbolos) revela três regimes diferentes: um rápido aumento da operação déta para t < 50 s, um regime intermediário para 50 s < t < 200 s, e um lento, mas quase contínuo aumento para t > 200 s. Os resultados experimentais foram simulados por meio de simulações de Monte Carlo; pseudo-primeira ordem cinética de reação com constantes de reação ki foram assumidos para a troca de H/D nos grupos funcionais das moléculas investigadas22. Um bom acordo entre simulações e resultados experimentais nos três regimes só foi obtido quando pelo menos três constantes de taxa diferente saem para a troca de H/D em moléculas de angiotração II foram aplicadas. Na Figura 5F,G,as cinéticas como deduzidas de encaixar os padrões experimentais de isótopos pela soma de padrões isótopos para diferentes graus de desoneração (Figura 5A a Figura 5D) são mostrados. O bom acordo entre dados experimentais e simulações, bem como as taxas de câmbio muito diferentes para baixos e altos graus de deutérios são claramente observados. Em comparação com diferentes oligopeptídeos, como a hexaglicina, as taxas de câmbio rápidas foram atribuídas aos grupos funcionais explícitos, enquanto as taxas de câmbio lentas estavam associadas aos grupos de amido da espinha dorsal22do peptídeo . Considerando que esses dois primeiros exemplos foram medidos com amostras de angiotração de espessura de micrometro iI, a Figura 6 mostra os resultados obtidos a partir da cobertura submonocamada de angiotensin II em amostras de ouro, conforme preparado por meio de deposição de feixe de íons eletrospray (ES-IBD)23. Observou-se dependência linear da intensidade do sinal na quantidade de substância, ao longo de 3 ordens de magnitude, a menor quantidade de substância detectada corresponde a 0,1% de uma monocamada de moléculas de angiotração II na superfície do ouro. Experimentos de troca de H/D, como mostrado na Figura 5, também foram realizados com angiotensin II em ouro no regimesubmonocamada 23. Figura 4: Observação em tempo real da degradação térmica da angiotração II. (A-C) Espectros de massa obtidos após desorpção/ionização induzida por cluster a partir de uma amostra de angiotensin II. (A) Amostra fresca na RT. (B) Amostra aquecida a aproximadamente 140 °C. Além do pico de m/z = 1047, que está associado à molécula intacta [M+H]+,picos em m/z = 932, 1012 e 1029 aparecem (indicados por setas). (C) Os últimos picos aumentam e o pico principal diminui com o tempo ao manter a amostra em temperatura elevada. (D) Fórmula estrutural da angiotração II indicando o fragmento (suportes marrons) que leva ao aparecimento do pico em m/z = 932 por perda de uma unidade de aminoácido (ácido aspartico). (E) Dependência de tempo da temperatura amostral e da intensidade dos principais picos indicados nas parcelas (A) a (C). Linhas sólidas são guias aos olhos. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 5: Observação em tempo real da troca de H/D em angiotensin II. (A-D) Espectra de massa cationic de angiotensin II obtido por meio do DINeC-MS. Devido à troca de H/D, o padrão isótopo amplia e muda para valores mais elevados de m/z em (B) para (D) quando comparado com o padrão isótopo das espécies não deuterated mostradas em (A). Linhas vermelhas são dados, linhas de cianos tracejadas são encaixadas nos dados levando em conta diferentes graus de dedeuteração. (E) Grau médio de dedeu terdiação dé diputada como função do tempo conforme deduzido dos experimentos (ponto aberto). Além disso, é mostrado díspido como função do tempo deduzido por meio de simulações de Monte Carlo. Curva preta tracejada: simulações levando em conta uma constante de taxa(k1); curva vermelha: levando em conta três constantes de taxa(k1, k2, k3). (F,G) Intensidades relativas de sinal de graus selecionados de desoneração da angiotração II (símbolos + linhas sólidas) em função do tempo, juntamente com os resultados correspondentes das simulações de Monte Carlo (linhas tracejadas). Este número foi modificado a partir da referência 22. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 6: Aplicação do DINeC-MS à angiotração II em ouro no regime submonocamada. (A) Representação esquemática da combinação de ES-IBD para deposição e DINeC-MS para espectrometria em massa de moléculas isoladas de angiotração II no regime submonocamada. (B) Dependência da intensidade do sinal na quantidade de substância depositada na amostra obtida a partir de dois conjuntos independentes de dados (símbolos preenchidos e abertos). Insets: Espectros de massa DINeC obtidos a partir de amostras nas quais uma quantidade de substância foi depositada como indicado. Este número foi modificado a partir da referência 23. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Discussion

Em muitos estudos realizados até agora, demonstrou-se uma alta sensibilidade do DINeC-MS sobre várias substâncias. De fato, isso permite medições de análites até uma quantidade de substância no regime femtomole¹¹. Devido a essa alta sensibilidade, a preparação da amostra, em particular a limpeza do substrato, deve ser realizada com produtos químicos altamente puros para evitar contaminação no espectro de massa DINeC. Como é o caso de muitas técnicas de análise, uma medição adequada de fundo de um substrato em branco ajuda a separar picos do analyte e picos que têm sua origem na preparação de substrato/amostra.

Embora tenhamos mostrado que a probabilidade de ionização de uma determinada molécula de analyte não é fortemente influenciada pela presença de co-adsorbates ou co-constituintes em amostras mistas¹⁷^,²⁴, a probabilidade de ionização pode variar de substância para substância¹³. Assim, é ainda mais importante trabalhar em condições limpas, pois contaminantes, dependendo de sua probabilidade de ionização, podem contribuir para o sinal muito mais forte do que o anatólito. Íons pré-formados (por exemplo, como encontrado no caso de muitas moléculas de tinta), ou moléculas com grupos funcionais que mostram uma clara tendência à captação ou deprotonação de prótons (ou seja, bases ou ácidos), normalmente mostram alta probabilidade de ionização no DINeC-MS. Se nenhum grupo funcional estiver presente no analyte, a probabilidade de ionização pode ser baixa. As amostras podem então ser tratadas por agentes ionizantes, como o ácido trifluoro (por exemplo, mediante exposição da amostra à pressão de vapor do agente ionizante).

Os resultados representativos discutidos na Figura 4 e Na Figura 5 demonstram a aplicabilidade do DINeC-MS para investigações em tempo real de reações químicas por meio de espectrometria de massa. A Figura 6 ilustra a sensibilidade do método. Se as duas propriedades forem combinadas, reações químicas em superfícies e seus produtos podem ser seguidas em tempo real²³. Isso pode ser em particular de interesse para a chamada “síntese na superfície” que leva à montagem de estruturas macromoleculares em superfícies³^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶. Na configuração atual, a observação dessas reações superficiais é possível em superfícies com menor reatividade, como ouro²³ e outros metais nobres; os experimentos são mais difíceis de serem realizados em superfícies altamente reativas, como superfícies de silício³⁷, já que a pressão base na câmara de desorcação está na faixa de 10^-7mbar. As atividades atuais abordam essa limitação e um aparelho DINeC compatível com UHV está sendo construído. No caso de superfícies reativas, a interação entre A OS₂ e a superfície do substrato deve ser testada antes das medições de adsorbates superficiais e reações superficiais.

Como o feixe de cluster é neutro, não pode ser focado. O tamanho do feixe na amostra é, portanto, dado pela geometria da configuração e orifício do skimmer em uso; valores típicos para o diâmetro do feixe na amostra é de um a vários milímetros. Como resultado, a imagem digitalizando a amostra só é possível com uma resolução muito baixa. Por outro lado, dada pela alta probabilidade de ionização^13,o DINeC eficientemente faz uso das moléculas desorbedas. Assim, uma combinação de DINeC-MS e um detector de imagens de íons³⁸ parece ser altamente atraente.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o apoio financeiro do Centro Internacional helmholtz para feira (HICforFAIR) e da Helmholtz Graduate School for Hadron and Ion Research (P.S.). Os autores agradecem ao Prof. Rauschenbach (Universidade de Oxford) e sua equipe por colaboração frutífera em experimentos combinados ES-IBD/DINeC.

Materials

Acetone rotisolv HPLC	Roth	7328.2	HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC	Roth	p076.1	HPLC Gradient Grade
Helium	Praxair	4800086706	Purity 99.9999%
Nitrogen	Praxair	40728408	Purity 99.5 – 100%
Silicon Wafers	Active Business Company GmbH	G60007
Sulfur dioxide	Air Liquide	P1734S10R0A001	Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS	Roth	HN43.1	Ultra LC-MS

References

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Bomhardt, K., Schneider, P., Portz, A., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60487, doi:10.3791/60487 (2020).

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