Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Karolin Bomhardt; Pascal Schneider; Andr&#233; Portz; Christoph  R. Gebhardt; Michael D&#252;rr

doi:10.3791/60487

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Chemistry

Analisi delle molecole complesse e delle loro reazioni sulle superfici mediante mezzi di desorpazione/spettrometria di massa indotta da cluster

Published: March 01, 2020

doi:

10.3791/60487

Karolin Bomhardt*¹, Pascal Schneider*¹, André Portz¹, Christoph R. Gebhardt², Michael Dürr¹

¹Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa),Justus Liebig University Giessen, ²Bruker Daltonik GmbH

Summary

Gli ammassi neutri di SO₂ di bassa energia cinetica (< 0,8 eV/costituente) vengono utilizzati per desorbiare molecole di superficie complesse come peptidi o lipidi per un'ulteriore analisi mediante spettrometria di massa utilizzando uno spettrometro di massa della trappola iografica. Non è necessaria alcuna preparazione speciale del campione e l'osservazione in tempo reale delle reazioni è possibile.

Abstract

La desorption/Ionizzazione indotta da Neutral SO₂ Clusters (DINeC) è impiegata come una tecnica di desorption/ionizzazione molto morbida ed efficiente per la spettrometria di massa (MS) di molecole complesse e le loro reazioni sulle superfici. DINeC si basa su un fascio di SO₂ cluster che impattano sulla superficie del campione a bassa energia a cluster. Durante l’impatto della superficie a grappolo, alcune molecole di superficie vengono desorbed e ionizzate per dissolvazione nel cluster di impatto; come risultato di questo meccanismo di desorption mediato dalla dissolvazione, è sufficiente una bassa energia a grappolo e il processo di desorption è estremamente morbido. Sia gli adsorbates superficiali che le molecole di cui è composta la superficie possono essere analizzati. Si ottengono spettri chiari e privi di frammentazione da molecole complesse come peptidi e proteine. DINeC non richiede alcuna preparazione speciale del campione, in particolare nessuna matrice deve essere applicata. Il metodo fornisce informazioni quantitative sulla composizione dei campioni; possono essere rilevate molecole a una copertura superficiale a partire da 0,1 % di un monostrato. Le reazioni superficiali come lo scambio H/D o la decomposizione termica possono essere osservate in tempo reale e la cinetica delle reazioni può essere dedotta. Utilizzando un ugello pulsato per la generazione di raggi a grappolo, DINeC può essere combinato in modo efficiente con la spettrometria di massa della trappola ionica. La natura senza matrice e morbida del processo DINeC in combinazione con le capacità MSⁿ della trappola ioleosa consente un’analisi molto dettagliata e inequivocabile della composizione chimica di campioni organici complessi e adsorbates organici sulle superfici.

Introduction

Le tecniche di analisi sensibili alle superfici sono spesso basate su sonde di particelle come elettroni a bassa energia, atomi o ioni che interagiscono fortemente con campioni solidi. Di conseguenza, mostrano un’elevata sensibilità alla superficie e informazioni dettagliate sulla struttura della superficie possono essere ottenute¹. Le informazioni chimiche, tuttavia, sono spesso limitate. Ad esempio, la spettroscopia fotoelettronica a raggi X può fornire informazioni quantitative sulla composizione atomica e sull’ambiente chimico medio di una data specie (ad esempio, gli atomi di carbonio in una molecola organica adsorbita su una superficie²). Tuttavia, informazioni più dettagliate sulle molecole complesse e adsorbite, come la loro struttura dettagliata o siti di legame, sono difficili da ottenere con tecniche standard di analisi della superficie. D’altra parte, la necessità di tali informazioni sta crescendo con il crescente interesse per la funzionalizzazione superficiale per mezzo di molecole organiche. I campi in espansione della sintesi su superficie³ o la funzionalizzazione superficiale mediante l’attaccamento di biomolecole⁴^,⁵ sono due esempi prominenti. In tutti questi campi, vengono studiate le questioni fondamentali sulle interazioni substrato-adsorbate e adsorbate-adsorbate al fine di comprendere meglio i sistemi. Per queste indagini, è auspicabile un massimo di informazioni sulle molecole adsorbite.

In parte, la spettrometria di massa iossuta secondaria (SIMS) può fornire tali informazioni. In primo luogo, SIMS è altamente sensibile alla superficie. In secondo luogo, poiché gli adsorbates sputtered e i loro frammenti vengono rilevati per mezzo di SM, si ottengono informazioni ben oltre la composizione atomica. A seconda della natura della specie chimica adsorbita sulla superficie, può essere identificata dalla sua massa molecolare e dal modello di frammento osservato nello spettro di massa⁶. I frammenti indotti dagli ioni primari possono infatti aiutare per l’identificazione del materiale analizzato. D’altra parte, se la modifica indotta dagli ioni primari (frammentazione, reazioni indotte dagli ioni, miscelazione) del campione è troppo forte, la maggior parte delle informazioni sullo stato originale del campione viene persa. Pertanto, sono stati compiuti grandi sforzi per ridurre la frammentazione nella SIMS (ad esempio, utilizzando cluster molecolari caricati come ioni primari⁷^,⁸^,⁹). Tuttavia, la frammentazione domina ancora gli spettri SIMS di grandi macromolecole e campioni biologici¹⁰, limitando l’applicazione di SIMS in vari campi.

In alternativa, abbiamo dimostrato desorption/ionization indotta da cluster neutrali (DINeC) come un metodo di ionizzazione morbido e privo di matrici che è stato impiegato con successo per l’analisi spettrometrica di massa di molecole complesse¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. DINeC si basa su un fascio di ammassi molecolari che consistono di 10³ a 10⁴ SO₂ molecole (Figura 1). Quando i cluster hanno un impatto sul campione, interagiscono in vari modi con le molecole su e in superficie: in primo luogo, una parte dell’energia cinetica dell’ammasso viene ridistribuita e attiva la desorption. Altrettanto importante, la molecola desorbing viene disciolta nel cluster durante l’impatto della superficie del cluster¹¹^,¹⁸^,¹⁹ ( Figura1 e Figura 2). In altre parole, sulla base del momento di dipolo elevato di SO₂, i cluster servono in modo molto efficiente come matrice transitoria per gli analiti polari. Di conseguenza, la desorption delle molecole di analita avviene a energie a grappolo a partire da 1 eV/molecola e sotto. La natura morbida del processo di spedizione è ulteriormente supportata dal raffreddamento rapido del sistema quando il cluster SO₂ si frantuma durante e dopo l’impatto superficiale¹¹^,¹⁹. Come conseguenza di questi vari aspetti, la desorption indotta da cluster di molecole complesse come peptidi, proteine, lipidi e coloranti procede senza alcuna frammentazione delle molecole desorbing¹¹^,¹⁵; gli spettri di massa tipici mostrano il picco dominante al valore m/z della molecola intatta ([M-H]^– o [M-H]^–, Figura 3). A seconda del numero e della natura dei gruppi funzionali nella molecola, più cazioni cariche nella forma [M H]^nè si osserva¹¹^,¹⁵^,¹⁸. Per le biomolecole, la ionizzazione avviene in genere tramite assorbimento o astrazione di un protone in un gruppo funzionale di base o acido, rispettivamente¹¹. Se le molecole d’acqua sono presenti nel campione,_{SO 2} molecole del cluster possono reagire con queste molecole d’acqua formando acido solforoso¹⁸. Quest’ultimo può agire come una fonte di protoni efficiente che promuove ulteriormente il processo di ionizzazione in caso di ionizzazione tramite assorbimento di protoni (modalità ionica positiva)¹³^,¹⁸.

Figura 1: Illustrazione schematica della desorption/ionizzazione indotta da cluster e dell’impostazione sperimentale. La desorption/ionizzazione indotta da ammassi viene eseguita in un recipiente ad alto vuoto. Un fascio di cluster SO₂ (punti gialli) viene prodotto tramite l’espansione supersonica di una miscela di gas SO₂/ He da un ugello pulsato. Durante l’impatto della superficie a grappolo, le molecole superficiali vengono desorbed e ionizzate. Gli ioni molecolari (punti rossi/arancioni) vengono trasferiti tramite una griglia di spoglio, una doppia entrata a imbuto iostico e guide agli ioni octopolari nella trappola iotetica per la spettrometria di massa. Gli spettri di massa tipici mostrano picchi dominanti ai valori m/z delle molecole intatte, qui: M1 (arancione) e M2 (rosso) in modalità iolato positivo. Esplosione: durante l’impatto della superficie del cluster, le molecole desorbed vengono disciolte nel cluster o in uno dei suoi frammenti. Ulteriori frantumazioni ed evaporazione delle molecole SO₂ portano poi allo ione molecolare nudo e intatto rilevato nello spettrometro di massa. Vedere anche Figura 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Istantanee di simulazioni di dinamiche molecolari che illustrano la desorption indotta da cluster tramite dissolvazione. (A) Un ammasso SO₂ (300 molecole) si avvicina alla superficie con 1250 m/s perpendicolari alla superficie su cui viene assorbito un dipeptide (acido acido appettivo-arginina, ASP-ARG). (B) Durante l’impatto della superficie del cluster, il cluster si frantuma. Il dipeptide adsorbito interagisce con le molecole SO₂ circostanti che portano alla sua dissolvazione in uno dei frammenti del cluster. (C) I frammenti del cluster vengono respinti dalla superficie. Il frammento etichettato (cerchio blu) trasporta il dipeptide che viene desorbed in questo frammento. Questa cifra è stata modificata rispetto al riferimento 19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Spettro di massa rappresentativo e modello molecolare di angiotensina II. (A) Spettri di massa (pannello superiore: modalità ioscione positivo, pannello inferiore: modalità iosinato negativo) come ottenuto dopo la desorption/ionizzazione indotta da cluster da un campione di angiotensina II. Il campione è stato preparato mediante drop-casting la rispettiva soluzione su un wafer Si (coperto dal suo ossido naturale). I picchi principali sono assegnati alla biomolecola intatta, [M-H]^e [M-H]^–; non si osservano modelli di frammentazione. I dimeri ([2M-H]^–, freccia) indicano ulteriormente la natura morbida del processo di desorption. Il segnale ioquello positivo è più intenso a causa dell’influenza dei cluster SO₂ ¹⁸. (B) Modello di riempimento dello spazio e sequenza di amminoacidi di angiotensina II. Le palline bianche indicano atomi di idrogeno; nero: carbonio; blu: azoto; rosso: ossigeno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

DINeC può essere applicato a qualsiasi tipo di campione solido che è compatibile con condizioni ad alto vuoto. Non è necessaria alcuna preparazione speciale del campione, in particolare nessuna matrice deve essere applicata prima delle misurazioni DINeC-MS, a differenza della spettrometria di massa MALDI (Matrix-assisted laser Desorption/ionizzazione) e delle relative tecniche²⁰^,²¹. Ciò consente misurazioni in tempo reale dei cambiamenti chimici del campione con condizioni sperimentali variabili come la pressione di fondo delle specie reattive nella camera sottovuoto²² o la temperatura del campione. È stato dimostrato che il limite di rilevazione del DINeC-MS si appaia nell’intervallo del femtomole¹¹. Quando applicato all’analisi delle biomolecole adsorbite su superfici solide nel regime del submonostrato, è stata rilevata una copertura superficiale a partire dallo 0,1% di un monostrato²³. In questo regime di copertura, l’intensità del segnale dipende linearmente dalla copertura superficiale e DINeC-MS può essere utilizzato per l’analisi quantitativa della composizione superficiale²³. Nel caso di campioni misti, è possibile una valutazione quantitativa della composizione del campione¹⁷^,²⁴, poiché non si osserva alcun effetto importante dell’ambiente chimico sulla probabilità di ionizzazione (ad esempio, nel caso di campioni misti di lipidi/peptidi¹⁷). Questo è in netto contrasto con la SIMS, per la quale la probabilità di ionizzazione di una determinata specie è tipicamente fortemente influenzata dalla presenza di diversi componenti chimici (il cosiddetto “effetto matrice”²⁵^,²⁶).

Oltre all’analisi della superficie, la composizione chimica nella regione del sottosuolo può essere sondata mediante la profilatura della profondità¹⁷. Con l’attuale set-up, i tipici tassi di desorption di desorption indotta da cluster di biomolecole sono dell’ordine 10^-3 nm/s. Per i campioni misti di lipidi/peptidi¹⁷è stata osservata una risoluzione ad alta profondità nell’intervallo da 1 a 2 nm.

Un ulteriore campo di applicazione è la combinazione di DINeC-MS con cromatografia a strati sottili (TLC). Le piastre TLC convenzionali possono essere analizzate direttamente mediante spettri di massa DIPENDENTI dalla posizione dalle piastre TLC e quindi cromatogrammi specifici per massa possono essere ottenuti dalle piastre TLC²⁷. Non è necessaria alcuna rielutazione degli analiti separati, diversa dal TLC in combinazione con ESI²⁸^,²⁹. Non è necessaria alcuna matrice per la combinazione DINeC-MS – TLC, a differenza dell’accoppiamento di TLC con MALDI²⁸^,²⁹.

La ionizzazione dell’elettrospray di degradazione (DESI) è anche un metodo di desorption/ionizzazione morbida per MS-applicazioni³⁰^,³¹. Le differenze più notevoli tra DINeC e DESI sono: la natura quantitativa del DINeC²³, la sua compatibilità con le condizioni a vuoto ultra-alto (UHV), in particolare la possibilità di studiare campioni preparati e trasferiti in condizioni UHV senza rompere il vuoto²³, così come la possibilità di desorgare in modo efficiente le molecole non polari¹⁹.

In linea di principio, DINeC come fonte di desorption/ionization può essere accoppiato a qualsiasi tipo di spettrometro di massa. Tuttavia, la combinazione con la spettrometria di massa trappola ionico presenta due vantaggi principali: in primo luogo, la larghezza dell’impulso e la velocità di ripetizione di un tipico fascio a gronforno pulsato corrispondono molto bene al tempo di accumulo discontinuo così come la velocità spettrale della trappola ionico¹⁵^,³². In secondo luogo, la natura morbida del processo DINeC porta alla desorption delle molecole intatte. In combinazione con le capacità MSⁿ della spettrometria di massa trappola iotecnica, questo consente un’analisi più completa dei campioni studiati¹⁵.

Protocol

NOTA: il protocollo può essere messo in pausa in qualsiasi momento. 1. Preparazione dei substrati Per i campioni standard, tagliare i substrati da wafer di silicio (spessore di circa 0,5 a 1 mm) in pezzi di 1 x 1 cm2. Pulire i substrati Si in un bagno ad ultrasuoni di etanolo e acetone per 15 min ciascuno. Asciugare i substrati in un flusso di gas di azoto secco. 2. Preparazione di campioni Preparazione del campione standard Per i campioni standard, preparare la soluzione contenente le molecole di analita in base alla questione scientifica da affrontare. La concentrazione dell’analita deve essere di almeno 1 x 10-10 mol/L. Gettare da 5 a 30 l della soluzione campione sul substrato. A seconda della pressione del vapore del solvente, lasciare asciugare il campione in condizioni ambientali o in un desiccatore fino a quando tutto il solvente è stato evaporato e si è formata una pellicola asciutta. A seconda della quantità di sostanza applicata, lo spessore della pellicola può essere compreso tra diversi dieci m (possibile ispezione visiva) e il monostrato al regime sub-monostrato (quindi non rilevabile a occhio). Montare i campioni sul supporto del campione (ad esempio, utilizzando nastro adesivo o morsetti serrati da viti, a seconda dei campioni e delle condizioni di vuoto richieste). Se possibile, montare sul supporto del campione un campione di riferimento, ad esempio una pellicola di angiotensina di spessore II, dello spessore di un campione. Preparazione alternativa del campione Utilizzare schemi di preparazione di campioni alternativi come la deposizione del fascio di ioni di elettrospray (ES-IBD) nel rivestimento sottovuoto o a tuffo in una rispettiva soluzione, se applicabile. Montare i campioni che devono essere preparati e trasferiti sottovuoto sul supporto del campione DINeC prima delle fasi di preparazione. Assicurarsi che i campioni rivestiti in tuffi siano asciutti dopo la fase di preparazione finale. Considerare lo schema di preparazione più semplice. Ad esempio, per l’indagine dell’inchiostro evidenziatore, basta disegnare un punto sulla superficie del substrato. 3. Trasferimento di campioni nello spettrometro di massa DINeC Trasferimento di campioni dalle condizioni ambientali nella camera DINeC evacuata Vent il sistema di blocco del carico. Aprire il blocco di carico e montare il supporto del campione. Chiudere il blocco di carico e pompare lungo la camera di carico-lock ad una pressione inferiore 2 x 10-5 mbar. Aprire la valvola alla camera DINeC e trasferire il supporto del campione con l’asta di trasferimento al manipolatore principale. Attaccare il supporto del campione al manipolatore. Ritirare l’asta di trasferimento e chiudere la valvola tra load-lock e camera DINeC. Trasferimento di campioni dal vuoto nella camera DINeC evacuata Utilizzare un contenitore sottovuoto trasportabile, che può essere collegato alla flangia CF40 della camera DINeC. Trasferire i campioni, che sono stati preparati nel vuoto, con questo contenitore senza rompere il vuoto. Assicurarsi che i campioni siano montati su un supporto campione compatibile con il manipolatore utilizzato nel sistema DINeC. Attaccare il contenitore sottovuoto trasportabile alla flangia CF40 e pompare lungo il volume tra il contenitore e la camera DINeC. Una volta che la pressione è scesa al di sotto di 2 x 10-5 mbar, aprire le valvole del cancello alla camera DINeC e al contenitore sottovuoto trasportabile e trasferire il campione nella camera DINeC sul manipolatore utilizzando una levetta oscillante o un altro sistema di trasferimento con più di 50 cm di movimento lineare. Ritirare il sistema di trasferimento e chiudere le due valvole di gate. 4. Preparazione della miscela di gas Preparare una miscela di circa 3% SO2 in elio evacuando prima le bombole di gas del sistema di miscelazione del gas per 10 min. Riempire i cilindri con SO2 fino a raggiungere una pressione di 1 barra. Riempire ulteriormente i cilindri con elio fino a raggiungere una pressione totale di 30 bar.AVVISO: Quando si utilizza SO2, le rispettive precauzioni di sicurezza come la conservazione di SO2 cilindri in armadi a gas designati devono sempre essere soddisfatte. 5. Preparazione dello spettrometro di massa DINeC Aprire la valvola tra la bombola del gas e l’ugello. Regolare la pressione della miscela di gas SO2/He al contorno del sistema di miscelazione del gas a 15 bar. Impostare la posizione del manipolatore sulla posizione del campione di riferimento. Per la misurazione degli spettri di massa cationici, impostare il campione e la distorsione della griglia rispettivamente su 40 e 7 V. Per azionare l’ugello pulsato e lo spettrometro di massa della trappola ionico, impostare il generatore di funzioni esterno su 2 Hz. Con il generatore di ritardo, impostare il ritardodi tempo n tra il segnale di trappola Clear dalla trappola ionico e il segnale di innesco per l’ugello pulsato a 5 ms. Nel software di controllo, regolare i seguenti parametri premendo i rispettivi pulsanti o digitando i rispettivi valori nella pagina Modalità della finestra di dialogo principale: Modalitàdi scansione : Risoluzione avanzata, Intervallo: m/z 50 – 3000, Accu-time: 0.1 ms, Media: 10 cicli, Polarità: positivo per la misurazione delle spettro di massa cationicoNOTA: Per misurare gli spettri anionici, la distorsione del campione e della griglia deve essere negativa rispetto al suolo, Polarity deve essere commutata su Negativo nel software di controllo. 6. Misurazione degli spettri di massa Una volta raggiunta una pressione inferiore a 3 x 10-6 mbar nella camera DINeC, la misurazione può essere avviata. Avviare la misurazione premendo prima Stand by e quindi premendo Operate nel software di controllo. Iniziare a registrare le misure premendo il pulsante Riproduci. Misurare uno spettro di prova da un campione di riferimento come l’angiotensina II per circa 300 s. Seguire la dipendenza temporale del segnale utilizzando il cromatogramma impostato sul rispettivo valore m/z. Ottimizzare l’intensità del segnale regolando il ritardo di tempo ntra il segnale di trappola Clear e il segnale che attiva l’ugello pulsato. Spostare il manipolatore nella posizione del campione da misurare. Ottimizzare l’intensità del segnale regolando la posizione del campione all’interno del piano di supporto del campione. Acquisire spettri di massa nell’arco di tempo di interesse. Modificare i parametri sperimentali come la temperatura del campione o la pressione di fondo nella camera in base ai dettagli dell’esperimento. Continuare a prendere spettri di massa quando si variabiliranno i parametri sperimentali. 7. Valutazione dei dati Al termine della misurazione, caricare il rispettivo set di dati nel programma di analisi dei dati. Selezionare l’intervallo di tempo di interesse nel cromatogramma con il pulsante destro del mouse. Lo spettro medio verrà visualizzato in una finestra separata. Esportare lo spettro come file di dati per un’ulteriore elaborazione in un programma di scelta.

Representative Results

Di seguito vengono presentati due esempi per l’applicazione in tempo reale di DINeC-MS. La figura 4 mostra il cambiamento dello spettro di massa ottenuto dall’angiotensina II quando il campione viene riscaldato a circa 140 gradi centigradi. Quando viene raggiunta la temperatura finale (Figura 4B, Figura 4E), lo spettro è caratterizzato da un picco aggiuntivo che indica la perdita di un’entità H2O (m/z – 1029). Mantenendo il campione a tale temperatura, si osserva un’ulteriore decomposizione delle molecole di angiotensina II (Figura 4C), compresa la perdita di una delle unità terminali di amminoacidi, come acido ppartic (picco a m/z – 932, Figura 4D). L’analisi quantitativa dei dati consente di valutare la cinetica di reazione sottostante (Figura 4E). In particolare, la Figura 4E dimostra che l’entità con m/z – 1029 è un intermedio che si decompone ulteriormente in frammenti più piccoli man mano che l’intensità aumenta e poi diminuisce. Le costanti del tasso concomitante sono quindi nello stesso ordine di grandezza. Come secondo esempio, lo studio dello scambio di idrogeno/deuterio in angiotensina II22 è illustrato nella figura 5. Dopo l’esposizione del campione di angiotensina a D2O nella camera DINeC (pD2O – 10-4 mbar), il modello isotopico di angiotensina II viene ampliato e spostato verso valori m/z più alti che indicano lo scambio di H dagli atomi di D. Il processo è veloce durante i primi 60 s ma rallenta significativamente nel corso dell’esperimento: il modello di isotopo nella Figura 5B copre un ampio intervallo m / z (circa 15 m / z unità). Quando definiamo il grado di deuterazione d come il numero di atomi H scambiati in una molecola, i valori di d tra d e 0 e d e 13 possono essere estratti dallo spettro. Nella Figura 5C, il motivo isotopo viene nuovamente ridotto in larghezza. Questa osservazione può essere attribuita all’intensità fortemente ridotta dei picchi che sono associati ai gradi di deuterazione più bassi. Nella Figura 5D, lo spettro viene visualizzato per tempi di reazione ancora più lunghi. La gamma m/z coperta rimane quasi la stessa, ma il centro di massa dello spettro si sposta ancora lentamente verso l’aumento dei valori m/z. Per lunghi tempi di esposizione, una parte delle molecole raggiunge il più alto grado di deuterazione, dmax n. 17. Corrisponde al numero massimo di atomi H scambiabili, dato dal numero di atomi Di H legati a gruppi funzionali come gli acidi carboxylici o i gruppi di ammine. Già dall’evoluzione temporale degli spettri, si può dedurre che lo scambio H/D avviene con diverse costanti di tasso. Per una descrizione quantitativa di questa osservazione, il grado medio di deuteration d è tracciato nella Figura 5E in funzione del tempo. L’ispezione dei risultati sperimentali (simboli) rivela tre diversi regimi: un rapido aumento del d- operativo per t < 50 s, un regime intermedio per 50 s < t < 200 s, e un aumento lento ma quasi continuo per t > 200 s. I risultati sperimentali sono stati simulati mediante simulazioni Monte Carlo; cinetica di reazione pseudo-primoordine con costanti di reazione ki sono state ipresunte per lo scambio H/D presso i gruppi funzionali delle molecole studiate22. Un buon accordo tra simulazioni e risultati sperimentali in tutti e tre i regimi è stato ottenuto solo quando sono state applicate almeno tre diverse costanti di tasso ki per lo scambio H/D nelle molecole angiotensine II. Nella figura 5F,G, vengono mostrati i cinetici dedotti dal montaggio dei modelli isotopi sperimentali per la somma dei modelli isotopici per diversi gradi di deutere (Figura 5a A a Figura 5D). Il buon accordo tra dati sperimentali e simulazioni, nonché i tassi di cambio molto diversi per bassi e alti gradi di deuterations sono chiaramente osservati. In confronto con diversi oligopeptidi come l’esagilia, i tassi di cambio veloci sono stati attribuiti ai gruppi funzionali espliciti, mentre i tassi di cambio lenti sono stati associati con i gruppi intermedi della spina dorsale del peptide22. Mentre questi primi due esempi sono stati misurati con campioni di angiotensina iOne di spessore micrometro, Figura 6 mostra i risultati ottenuti dalla copertura di angiotensore di angiotensina II su campioni d’oro come preparato per mezzo di deposizione di fascio di ioni di elettrospray (ES-IBD)23. Una dipendenza lineare dell’intensità del segnale dalla quantità di sostanza si osserva su 3 ordini di grandezza, la quantità più bassa di sostanza rilevata corrisponde allo 0,1% di un monostrato di molecole angiotensina II sulla superficie dell’oro. Gli esperimenti di scambio H/D come illustrato nella Figura 5 sono stati eseguiti anche con angiotensina II sull’oro nel regime submonolayer23. Figura 4: Osservazione in tempo reale della degradazione termica dell’angiotensina II. (A-C) Spettri di massa ottenuti dopo la desorption/ionizzazione indotta da cluster da un campione di angiotensina II. (A) Campione fresco a RT. (B) Campione riscaldato a circa 140 gradi centigradi. Oltre al picco a m/z – 1047, che è associato alla molecola intatta [M-H]-vengono visualizzati picchi a m/z – 932, 1012 e 1029 (indicati da frecce). (C) Questi ultimi picchi aumentano e il picco principale diminuisce con il tempo quando si mantiene il campione a temperatura elevata. (D) Formula strutturale di angiotensina II che indica il frammento (parentesi brune) che porta alla comparsa del picco a m/z – 932 per perdita di un’unità di amminoacidi (acido apartito). (E) Dipendenza temporale della temperatura del campione e dell’intensità dei picchi principali indicati nei lotti (A) a (C). Le linee continue sono guide all’occhio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Osservazione in tempo reale dello scambio di H/D in angiotensina II. (A-D) Spettri di massa cationici di angiotensina II come ottenuto per mezzo di DINeC-MS. A causa dello scambio H/D, il modello isotopo si allarga e si sposta verso valori m/z più elevati in (B) a (D) rispetto al modello isotopico delle specie non deutedededed mostrate in (A). Le linee rosse sono dati, le linee ciano tratteggiate si adattano ai dati tenendo conto dei diversi gradi di deutereration. (E) Grado medio di deuteretazione d- in funzione del tempo come dedotto dagli esperimenti (punti aperti). Inoltre, viene mostrata la funzione del tempo descritto mediante simulazioni Monte Carlo. Curva tratteggiata nera: simulazioni tenendo conto di una costante di tasso (k1); curva rossa: tenendo conto di tre costanti di frequenza (k1, k2, k3). (F,G) Intensità di segnale relative dei gradi di deuterazione selezionati di angiotensina II (simboli e linee continue) in funzione del tempo insieme ai risultati corrispondenti delle simulazioni Monte Carlo (linee tratteggiate). Questa cifra è stata modificata dal riferimento 22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Applicazione del DINeC-MS all’angiotensina II sull’oro nel regime del submonostrato. (A) Rappresentazione schematica della combinazione di ES-IBD per la deposizione e DINeC-MS per la spettrometria di massa di molecole di angiotensina isolata II nel regime di submonolivello. (B) Dipendenza dell’intensità del segnale sulla sostanza di importo depositata sul campione, ottenuta da due serie indipendenti di dati (simboli riempiti e aperti). Insets: Spettri di massa DINEC ottenuti da campioni su cui è stata depositata una quantità di sostanza come indicato. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

In molti studi effettuati finora, è stata dimostrata un’alta sensibilità del DINeC-MS su varie sostanze. Ineffetti, questo permette di misurazioni degli analiti fino a una quantità di sostanza nel regime femtomole¹¹. A causa di questa elevata sensibilità, la preparazione del campione, in particolare la pulizia del substrato, deve essere eseguita con sostanze chimiche altamente pure al fine di evitare la contaminazione negli spettri di massa DINEC. Come nel caso di molte tecniche di analisi, una corretta misurazione di fondo da un substrato vuoto aiuta a separare i picchi dall’analita e i picchi che hanno la loro origine nella preparazione del substrato/campione.

Anche se abbiamo dimostrato che la probabilità di ionizzazione di una determinata molecola di analita non è fortemente influenzata dalla presenza di co-adsorbates o co-costituenti in campioni misti¹⁷^,²⁴, la probabilità di ionizzazione può variare da sostanza a sostanza¹³. Pertanto, è ancora più importante lavorare in condizioni pulite poiché i contaminanti, a seconda della loro probabilità di ionizzazione, possono contribuire al segnale molto più forte dell’analita. Ioni preformati (ad esempio, come nel caso di molte molecole di colorante), o molecole con gruppi funzionali che mostrano una chiara tendenza verso l’assorbimento di protoni o la deprotonazione (cioè basi o acidi), mostrano in genere un’elevata probabilità di ionizzazione nel DINeC-MS. Se tale gruppo funzionale non è presente nell’analita, la probabilità di ionizzazione può essere bassa. I campioni possono quindi essere trattati da agenti ionizzanti come l’acido trifluoro (ad esempio, dall’esposizione del campione alla pressione del vapore dell’agente ionizzante).

I risultati rappresentativi discussi nella Figura 4 e nella Figura 5 dimostrano l’applicabilità di DINeC-MS per le indagini in tempo reale sulle reazioni chimiche mediante la spettrometria di massa. Figura 6 illustra la sensibilità del submonolayer del metodo. Se le due proprietà sono combinate, reazioni chimiche sulle superfici e sui loro prodotti possono essere seguite in tempo reale²³. Questo può essere particolarmente interessante per la cosiddetta “sintesi in superficie” che porta all’assemblaggio di strutture macromolecolari sulle superfici³^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶. Nell’attuale configurazione, l’osservazione di tali reazioni superficiali è possibile su superfici con minore reattività come l’oro²³ e altri metalli nobili; gli esperimenti sono più difficili da eseguire su superfici altamente reattive come le superfici di silicio³⁷, poiché la pressione di base nella camera di spedizione è nella gamma 10^-7-mbar. Le attività attuali affrontano questa limitazione e si sta costruendo un apparato DINeC compatibile con UHV. Nel caso di superfici reattive, l’interazione tra SO₂ e la superficie del substrato deve essere testata prima delle misurazioni degli adsorbati superficiali e delle reazioni superficiali.

Poiché il fascio a grappolo è neutro, non può essere focalizzato. La dimensione del fascio sul campione è quindi data dalla geometria dell’allestito e dell’orifizio dello skimmer in uso; I valori tipici del diametro del fascio sul campione sono da uno a più millimetri. Di conseguenza, l’imaging mediante la scansione del campione è possibile solo con una risoluzione molto bassa. D’altra parte, data dall’alta probabilità di ionizzazione¹³, DINeC fa uso efficiente delle molecole desorbed. Pertanto, una combinazione di DINeC-MS e un rilevatore di imaging ionico³⁸ sembra essere molto attraente.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del Helmholtz International Center for FAIR (HICforFAIR) e della Helmholtz Graduate School for Hadron and Ion Research (P.S.). Gli autori ringraziano il professor Rauschenbach (Università di Oxford) e il suo team per una fruttuosa collaborazione su esperimenti combinati ES-IBD/DINeC.

Materials

Acetone rotisolv HPLC	Roth	7328.2	HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC	Roth	p076.1	HPLC Gradient Grade
Helium	Praxair	4800086706	Purity 99.9999%
Nitrogen	Praxair	40728408	Purity 99.5 – 100%
Silicon Wafers	Active Business Company GmbH	G60007
Sulfur dioxide	Air Liquide	P1734S10R0A001	Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS	Roth	HN43.1	Ultra LC-MS

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Bomhardt, K., Schneider, P., Portz, A., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60487, doi:10.3791/60487 (2020).

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