Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Karolin Bomhardt; Pascal Schneider; Andr&#233; Portz; Christoph  R. Gebhardt; Michael D&#252;rr

doi:10.3791/60487

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

ניתוח של מולקולות מורכבות והתגובות שלהם על משטחים באמצעות מצבר-המושרה באמצעות אשכול/אינון המסה ספקטרומטריה

Published: March 01, 2020

doi:

10.3791/60487

Karolin Bomhardt*¹, Pascal Schneider*¹, André Portz¹, Christoph R. Gebhardt², Michael Dürr¹

¹Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa),Justus Liebig University Giessen, ²Bruker Daltonik GmbH

Summary

נייטרלי SO₂ אשכולות של אנרגיה קינטית נמוכה (&Lt; 0.8 eV/בוחרים) משמשים desorb מולקולות פני השטח מורכבים כגון פפטידים או שומנים לניתוח נוסף באמצעות ספקטרומטר מסה באמצעות ספקטרומטר המסה של מלכודת יונים. אין צורך בהכנה לדוגמה מיוחדת, וניתן להתבונן בזמן אמת על תגובות.

Abstract

ספיחה/אינון הנגרמת על ידי נייטרלי אז₂ אשכולות (dinec) הוא מועסק כטכניקה מאוד רך ויעיל מאוד/ionization עבור ספקטרומטר המסה (MS) של מולקולות מורכבות ואת התגובות שלהם על משטחים. DINeC מבוסס על קרן של SO₂ אשכולות להשפיע על משטח המדגם באנרגיה אשכול נמוך. במהלך השפעת שטח האשכול, חלק ממולקולות פני השטח הם desorbed ומיוהם באמצעות חומר מדלל באשכול המשפיעים; כתוצאה של מנגנון זה לפירוק מתווך desorption האנרגיה האשכול נמוכה מספיקה, תהליך desorption הוא רך מאוד. שני בייטס ומולקולות של המשטח ניתן לנתח. ברור ומפוצל ללא ספקטרום ממולקולות מורכבות כגון פפטידים וחלבונים מתקבלים. DINeC אינו דורש שום הכנה לדוגמה מיוחדת, במיוחד אין להחיל מטריצה. השיטה מפיקה מידע כמותי על הרכב הדגימות; מולקולות בשטח כיסוי נמוך כמו 0.1% של מונאולייר ניתן להבחין. תגובות פני השטח כגון חילופי H/D או פירוק תרמי ניתן לצפות בזמן אמת ואת קינטיקה של התגובות ניתן להסיק. באמצעות זרבובית פעמו עבור הדור קרן אשכול, DINeC ניתן לשלב ביעילות עם מלכודת יונים המסה הספקטרומטר. מטריצה נטולת הטבע הרך של התהליך DINeC בשילוב עם יכולות MSⁿ של מלכודת יונים מאפשר ניתוח מפורט מאוד חד משמעי של ההרכב הכימי של דגימות אורגניות מורכבות ובייטס אורגני על משטחים.

Introduction

טכניקות ניתוח רגישות לפני השטח מבוססות לעתים קרובות על בדיקות חלקיקים כגון אלקטרונים בעלי אנרגיה נמוכה, אטומים, או יונים אשר מתקשרים בחוזקה עם דגימות מוצקות. כתוצאה מכך, הם מראים רגישות משטח גבוה ומידע מפורט על מבנה פני השטח ניתן להשיג¹. מידע כימי, לעומת זאת, מוגבל לעתים קרובות. לדוגמה, הספקטרוסקופיית פוטואלקטרון מסוג X-ray יכול להעניק מידע כמותי על הקומפוזיציה האטומית ועל הסביבה הכימית הממוצעת של מינים מסוימים (למשל, אטומי הפחמן במולקולה אורגנית על פני משטח²). עם זאת, מידע מפורט יותר על מולקולות מורכבות משטח, כגון המבנה המפורט שלהם או אתרי הכריכה, קשה להשגה עם טכניקות ניתוח משטח סטנדרטי. מצד שני, הצורך במידע כזה גדל עם העניין הגובר בפונקציונליות של פני השטח באמצעות מולקולות אורגניות. התחומים המתרחבים של סינתזה על פני השטח³ או פונקציונליזציה של פני השטח על-ידי צירוף של biomolecules⁴^,⁵ הם שתי דוגמאות בולטות. בכל התחומים האלה, שאלות בסיסיות על המצע-adsorbate ו adsorbate-adsorbate האינטראקציות נחקרים על מנת להבין טוב יותר את המערכות. עבור חקירות אלה, מידע מרבי על מולקולות נספחת רצוי.

בין השאר, הספקטרומטר המסה (סימס) של יונים משניים יכול להעניק מידע כזה. ראשית, סימס הוא רגיש מאוד לפני השטח. שנית, כמו בייטס ושברים שלהם מזוהים באמצעות MS, מידע היטב מעבר הרכב אטומי מתקבל. בהתאם לאופיו של המין הכימי נספחת על פני השטח, זה יכול להיות מזוהה על ידי מסה מולקולרית שלה דפוס קטע נצפתה בספקטרום ההמוני⁶. השברים המושרה על ידי היונים העיקריים אכן יכולים לסייע לזיהוי החומר שנותח. מצד שני, אם השינוי ביון הראשוני (הפיצול, המושרה התגובות, ערבוב) של המדגם חזק מדי, רוב המידע על המצב המקורי של המדגם הוא איבד. לפיכך, המאמצים העיקריים נעשו כדי להפחית את הפיצול של סימס (למשל, באמצעות אשכולותמולקולרית טעונה כיוני^{הראשי 7,}⁸^,⁹). עם זאת, הפיצול עדיין שולט ספקטרום של סימס של קרו גדול ודגימות ביולוגיות¹⁰, הגבלת היישום של סימס בתחומים שונים.

כחלופה, הצגנו desorption/אינון הנגרמת על ידי אשכולות ניטרליים (dinec) להיות שיטת יינון רך ונטול מטריצה אשר הועסק בהצלחה עבור ניתוח ספקטרומטר המוני של מולקולות מורכבות¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. DINeC מבוסס על קרן של אשכולות מולקולריים המורכבים 10³ עד 10⁴ כל כך₂ מולקולות (איור 1). כאשר האשכולות משפיעים על המדגם, הם מתקשרים בדרכים שונות עם המולקולות על פני השטח: הראשון, חלק מהאנרגיה הקינטית של האשכול מחולקת מראש ומפעילה הפחתת ספיחה. בדומה לכך, המולקולה של desorbing מומסים באשכול במהלך השפעת שטח האשכול¹¹^,¹⁸^,¹⁹ (איור 1 ואיור 2). במילים אחרות, מבוסס על הרגע דיפול גבוה של SO₂, אשכולות ביעילות מאוד לשמש מטריצה ארעית עבור מנתחי הקוטב. כתוצאה מכך, ספיחה של מולקולות האנליטה מתרחשת באנרגיות אשכול נמוך כמו eV/מולקולה ומתחת. האופי הרך של תהליך desorption הוא נתמך עוד יותר על ידי קירור מהיר של המערכת כאשר האשכול כל כך₂ לנפץ במהלך ואחרי ההשפעה על פני השטח¹¹^,¹⁹. כתוצאה של היבטים אלה שונים, המושרה אשכול desorption של מולקולות מורכבות כגון פפטידים, חלבונים, שומנים, וצבעים ההכנסות ללא כל פיצול של מולקולות desorption¹¹^,¹⁵; ספקטרום מסה אופייני מראה את השיא הדומיננטי בערך m/z של המולקולה השלמה ([m + h]⁺ או [m-h]^–, איור 3). בהתאם למספר ולאופי הקבוצות הפונקציונליות במולקולה, מספר הלישות שחויבו מרובים של הטופס [M + n · H]^{n +} נצפו¹¹^,¹⁵^,¹⁸. עבור biomolecules, יינון בדרך כלל מתרחשת באמצעות ספיגת או הפשטה של פרוטון בקבוצה בסיסית או חומצית פונקציונלית, בהתאמה¹¹. אם מולקולות מים נמצאים במדגם, אז₂ מולקולות מתוך האשכול יכול להגיב עם אלה מולקולות מים להרכיב חומצה גופריתית¹⁸. האחרון יכול לשמש כמקור פרוטון יעיל אשר מקדם את תהליך היינון במקרה של אינון באמצעות ספיגת פרוטון (מצב יון חיובי)¹³^,¹⁸.

איור 1: איור סכמטי של האשכול המושרה/אינון והגדרת ניסיוני. מתבצע בכלי קיבול ואקום גבוה. קרן של SO₂ אשכולות (נקודות צהובות) מופק באמצעות הרחבה קולית של a so₂/he גז תערובת של זרבובית פעמו. במהלך השפעת שטח אשכול, מולקולות פני השטח הם desorbed ומיומים. יונים מולקולריים (נקודות אדומות/כתומות) מועברים באמצעות רשת מוטה, כניסת משפך יונים כפולה, ומדריכי יון אוקטוולאר למלכודת היונים עבור ספקטרומטר מסה. ספקטרום המסה אופייני להראות פסגות דומיננטי בערכי m/z של המולקולות שלמות, כאן: M1 (כתום) ו-M2 (אדום) במצב יון חיובי. לפוצץ: במהלך ההשפעה על פני השטח אשכול, מולקולות desorbed מומס באשכול להשפיע או אחד השברים שלה. ניפוץ נוסף אידוי של SO₂ מולקולות ולאחר מכן להוביל את היון המולקולרי חשופים, שלמים כפי שזוהו ספקטרומטר המסה. ראה גם איור 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות של סימולציות דינמיקה מולקולריות הממחישות את האשכולות המושרה באמצעות חומר מדלל. (א) אשכול SO₂ (300 מולקולות) מתקרב לפני השטח עם 1250 מעלות-מים בניצב על פני השטח שבו דיפפטיד (חומצה אספטית-ARGININE, ASP-arg) הוא adsorbed. (ב) במהלך השפעת פני אשכול, האשכול מנפצת. Dipeptide מיטה האינטראקציה עם הסביבה אז₂ מולקולות המובילות החומר שלה באחד מקטעי אשכול. (ג) שברי האשכול משתרידים מפני השטח. החלק המסומנת (העיגול הכחול) נושא את הדיפפטיד שהוא desorbed ברסיס זה. דמות זו השתנתה מהפניה 19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מייצג ספקטרום המסה ומודל מולקולרי של אנגיוטנסין II. (A) ספקטרום מסה (הפאנל העליון : מצב יון חיובי, הלוח התחתון: מצב יון שלילי) כפי שהושג לאחר האשכול המושרה/אינון של המדגם אנגיוטנסין II. המדגם הוכן על ידי drop-להטיל את הפתרון המתאים על וופל סי (מכוסה על ידי תחמוצת הטבעי שלה). הפסגות הראשיות מוקצות לסמנים שלמים, [M + H]⁺ ו [m-h]^–; דפוסי הפיצול לא נצפו. Dimers ([2M + H]⁺, חץ) מציינים עוד יותר את האופי הרך של תהליך הדסורזיה. אות היון החיובי הוא אינטנסיבי יותר עקב ההשפעה של כ₂ אשכולות¹⁸. (ב) חלל-דגם מילוי וחומצת אמינו של אנגיוטנסין II. כדורים לבנים מצביעים על אטומי מימן; שחור: פחמן; כחול: חנקן; אדום: חמצן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

DINeC ניתן להחיל על כל סוג של מדגם מלא אשר תואם עם תנאי ואקום גבוהה. אין צורך בהכנה לדוגמה מיוחדת, במיוחד אין להחיל מטריצה לפני מדידות dinec-MS, בניגוד לחומר לייזר בעזרת מטריקס באמצעות מטריצה באמצעות מטריצות (maldi) וטכניקות קשורות²⁰^,²¹. זה מאפשר בזמן אמת מדידות של שינויים כימיים של המדגם עם מצבים ניסיוניים שונים כגון לחץ הרקע של מינים ראקטיבית בחדר ואקום²² או לדוגמה טמפרטורה. מגבלת הזיהוי של DINeC-MS הוכח להיות בטווח הפרמי¹¹. כאשר מיושם ניתוח של biomolecules נספחת על משטחים מוצקים במשטר submonolayer, שטח הכיסוי נמוך כמו 0.1% של מונאולייר זוהה²³. במשטר זה כיסוי, עוצמת האות תלויה בצורה קווית על כיסוי פני השטח ו DINeC-MS ניתן להשתמש עבור ניתוח כמותי של הרכב פני השטח²³. במקרה של דגימות מעורבות, הערכה כמותית של ההרכב לדוגמה היא אפשרית¹⁷^,²⁴, כמו לא השפעה מרכזית של הסביבה הכימית על ההסתברות יינון הוא נצפתה (למשל, במקרה של שומנים מעורבים/פפטיד דגימות¹⁷). מדובר בניגוד ברור לסימס, שעבורו ההסתברות האינון של מינים מסוימים מושפעת בדרך כלל מנוכחותם של מרכיבים כימיים שונים (“אפקט המטריצה”,²⁵^,²⁶).

בנוסף לניתוח פני השטח, הרכב כימי באזור התת-משטח ניתן לבדיקה באמצעות פרופיל עומק¹⁷. עם ההגדרה הנוכחית, שיעורי הספיחה האופייניים של האשכול המושרה באשכולות של biomolecules הם של הסדר 10^-3 ננומטר/s. ברזולוציה גבוהה מאוד בטווח של 1 כדי 2 ננומטר נצפתה עבור דגימות השומנים/פפטיד מעורבת¹⁷.

שדה נוסף של יישום הוא שילוב של DINeC-MS עם כרומטוגרפיה שכבה דקה (ועוד). צלחות ה-ומלא קונבנציונאלי ניתן לנתח ישירות באמצעות DINeC-MS. מיקום התלוי ספקטרום מסה ניתן לרכוש מן לוחות ובכך כרומטוגרמות המסה ספציפית ניתן לקבל מן לוחות החום²⁷. לא משחררי את האנליטים המופרדים הכרחית, שונה מאהבה בשילוב עם²⁸^,²⁹. אין צורך במטריצה עבור השילוב של dinec-MS +, בניגוד לזיווג של אהבה עם maldi²⁸^,²⁹.

דיסורזיה אלקטרונון (דזי) היא גם שיטת הדסורזיה רכה/יינון ליישומים של MS³⁰^,³¹. ההבדלים הבולטים ביותר בין DINeC ו-דזי הם: הטבע הכמותי של DINeC²³, התאימות שלה עם התנאים ultra-high-ואקום (UHV), בפרט את האפשרות לחקור דגימות שהוכנו והועברו בתנאים UHV ללא שבירת ואקום²³, כמו גם אפשרות desorb ביעילות מולקולות nonpolar¹⁹.

בעיקרון, מקור DINeC כמו desorption/ionization יכול להיות משולב לכל סוג של ספקטרומטר המסה. עם זאת, השילוב עם השמנה מלכודת יונים המסה תכונות שני יתרונות עיקריים: ראשון, רוחב הדופק וקצב החזרה של קרן האשכול פעמו אופייני תואמים היטב את הזמן הצטברות בלתי רציפה, כמו גם את הקצב הספקטרלי של מלכודת היונים¹⁵^,³². שנית, האופי הרך של התהליך DINeC מוביל לספיחה של מולקולות שלמות. בשילוב עם יכולות MSⁿ של מלכודת יונים הספקטרומטר מסה, זה מאפשר ניתוח מקיף ביותר של דגימות נחקרו¹⁵.

Protocol

הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בכל עת. 1. הכנת מצעים עבור דגימות סטנדרטיות, לחתוך את מצעים מ סיליקון (עובי של כ. 0.5 עד 1 מ”מ) בחתיכות של 1 x 1 ס מ2. נקה את מצעים Si באמבט אולטרסאונד של אתנול ואצטון עבור 15 דקות כל אחד. ייבש את הסובסטרטים. בזרם של גז חנקן יבש 2. הכנת דגימות הכנה לדוגמא סטנדרטית עבור דגימות סטנדרטיות, להכין את הפתרון המכיל את מולקולות האנליטה על פי השאלה המדעית להיות ממוען. ריכוז האנליטה צריך להיות לפחות 1 x 10-10 מול/L. Drop-יצוקה 5 עד 30 μL של פתרון לדוגמה על מצע. בהתאם ללחץ אדים של הממס, לתת את המדגם יבש תחת תנאי הסביבה או desiccator עד כל הממס התאדה וסרט יבש נוצר. בהתאם לכמות החומר המוחל, עובי הסרט יכול להיות בין מספר 10 יקרומטר (בדיקה חזותית אפשרית) והמונאולייר למשטר תת-מונאולייר (ובכך לא ניתן לראות אותו בעין). הר את הדגימות על מחזיק המדגם (למשל, באמצעות סרט דביק או מלחציים הידק ברגים, בהתאם לדגימות ומצבי ואקום נדרש). אם אפשר, בנוסף לטעון מדגם הפניה כגון סרט מיקרומטר-עבה של אנגיוטנסין II, על מחזיק המדגם. הכנה לדוגמא אלטרנטיבית השתמש בערכות הכנה לדוגמה חלופית כגון הפקדת הקרן יון (ES-IBD) בציפוי ואקום או מטבל בפתרון בהתאמה אם הדבר ישים. דגימות הר אשר להיות מוכנים והועברו ואקום על מחזיק המדגם DINeC לפני שלבי ההכנה. ודא שדגימות הציפוי מטבילה יבשות לאחר שלב ההכנה הסופי. . תחשיב את תוכנית ההכנה הפשוטה ביותר כדוגמה, עבור החקירה של דיו עט סימון, פשוט לצייר נקודה על פני המצע. 3. העברת דגימות לספקטרומטר מסה של DINeC העברת דגימות מתנאי הסביבה לחדר DINeC שפונו . פרוק את מערכת נעילת המטען פתח את נעילת המטען והבהר את מחזיק הדגימה. סגור את המטען לנעול ולשאוב למטה את התא מנעול העומס ללחץ מתחת 2 x 10-5 mbar. פתח את השסתום לחדר DINeC ולהעביר את המחזיק לדוגמה עם מוט ההעברה כדי מניפולטור הראשי. לחבר את מחזיק המדגם על מניפולטור. למשוך את מוט העברת ולסגור את השסתום בין עומס לנעול ו DINeC קאמרית. העברת דגימות מוואקום לתוך חדר DINeC שפונו השתמש מיכל ואקום היביל, אשר ניתן לצרף את CF40 מקורבות של התא DINeC. העבר את הדגימות, אשר הוכנו בוואקום, עם המיכל הזה מבלי לשבור את הוואקום. ודא כי הדגימות מותקן על מחזיק מדגם תואם עם הניפולטור המשמש במערכת DINeC. לחבר את המיכל ואקום היביל כדי מקורבות CF40 ולשאוב את הנפח בין המיכל לבין החדר DINeC. לאחר הלחץ ירד מתחת 2 x 10-5 mbar, לפתוח את שסתומי השער אל הקאמרית dinec ואת המיכל ואקום התחבורה ולהעביר את המדגם לתוך החדר dinec על מניפולטור באמצעות מקל הרעדה או מערכת העברה אחרת עם יותר מ 50 ס מ תנועה ליניארית. למשוך את מערכת ההעברה ולסגור את שני שסתומי השער. 4. הכנת תערובת הגז הכינו תערובת של כ. 3% SO2 ב הליום על ידי פינוי המוני גז של מערכת ערבוב הגז עבור 10 דקות. למלא את צילינדרים עם SO2 עד לחיצה של 1 בר מגיע. עוד למלא את הגלילים עם הליום עד הלחץ הכולל של 30 בר הוא הגיע.התראה: בעת שימוש ב-SO2, אמצעי הזהירות המתאימים כגון אחסון SO2 צילינדרים בארונות גז מיועדים תמיד להתממש. 5. הכנת ספקטרומטר מסה של DINeC פתח את השסתום בין. צילינדר הגז לזרבובית להתאים את הלחץ של התערובת SO2/he גז על קו המתאר של מערכת ערבוב הגז ל 15 בר. הגדר את המיקום של מניפולטור למיקום של דגימת ההפניה. עבור מדידת ספקטרום המסה הפחתת, להגדיר את מדגם הטיה הרשת ל + 40 ו-+7 V, בהתאמה. כדי לנהוג בזרבובית הפעמו ובספקטרומטר המסה של מלכודת היונים, הגדר את מחולל הפונקציה החיצוני ל-2 Hz. עם מחולל ההשהיה, קבע את השהיית הזמן Δtn בין אות המלכודת הנקי ממלכודת היונים לבין אות ההדק של החרירים הפעמו ל-5 אלפיות הראשונה. בתוכנת הבקרה, התאם את הפרמטרים הבאים על-ידי לחיצה על הלחצנים המתאימים או הקלדת הערכים המתאימים בעמוד המצב של חלון הדיאלוג הראשי: מצב סריקה: רזולוציה משופרת, טווח: m/z 50 – 3000, Accu-זמן: 0.1 ms, ממוצע: 10 מחזורים, קוטביות: חיובי למדידה של ספקטרום מסה של ההערה: למדידת ספקטרום אנייוני, הטיית המדגם והרשת צריכה להיות שלילית ביחס לקרקע, יש להחליף את הקוטביות לשלילי בתוכנת הבקרה. 6. מדידה של ספקטרום מסה פעם לחץ מתחת 3 x 10-6 mbar כבר הגיע בחדר dinec, המדידה ניתן להתחיל. הפעל את המדידה על-ידי לחיצה ראשונה על העמוד ולאחר מכן הקשה על פעולה בתוכנת הבקרה. התחל להקליט את המדידות הדוחפות את לחצן ההפעלה . מדידת ספקטרום בדיקה ממדגם התייחסות כגון אנגיוטנסין II עבור כ 300 s. בצע את התלות בזמן של האות באמצעות כרומטוגרמה לערך m/z המתאים. מטב את עוצמת האות באמצעות התאמה של השהיית הזמן Δtn בין אות ההשמנה הנקיה והאות המפעיל את החרירים הפעמו. הזז את מניפולטור למיקום המדגם שנמדד. מטב את עוצמת האות באמצעות התאמה של מיקום המדגם בתוך מישור מחזיק המדגם. לרכוש ספקטרום מסה על טווח הזמן של ריבית. שינוי הפרמטרים הניסיוניים כגון טמפרטורה לדוגמה או לחץ רקע בחדר לפי פרטי הניסוי. המשך לקחת ספקטרום מסה כאשר שונים את הפרמטרים הניסיוניים. 7. הערכת נתונים לאחר סיום המדידה, טען את ערכת הנתונים המתאימה בתוכנית לניתוח נתונים . בחר את טווח הזמן של הריבית ב chromatogram עם הלחצן הנכון של העכבר. הספקטרום הממוצע יוצג בחלון נפרד. ייצוא הספקטרום כקובץ נתונים לעיבוד נוסף בתוכנית הבחירה.

Representative Results

בשלב הבא, שתי דוגמאות ליישום בזמן אמת של DINeC-MS מוצגים. איור 4 מראה את השינוי בספקטרום ההמוני שהתקבל מ-אנגיוטנסין II כאשר המדגם מחומם לכ-140 ° c. כאשר הטמפ ‘ הסופית מגיעה (איור 4ב’, איור 4E), הספקטרום מאופיין בשיא נוסף המציין את אובדן של ישות H2O (m/z = 1029). בעת שמירה על המדגם בטמפרטורה זו, התפרקות נוספת של מולקולות אנגיוטנסין II הוא נצפתה (איור 4ג), כולל אובדן של אחד היחידות חומצות אמינו מסוף, אספרטית חומצה (שיא ב m/z = 932, איור 4ד). ניתוח כמותי של הנתונים מאפשר להעריך את קינטיקה התגובה הבסיסית (איור 4E). בפרט, איור 4E ממחיש כי הישות עם m/z = 1029 הוא ביניים אשר מפרק עוד יותר לרסיסים קטנים ככל שעוצמת הגדילה הראשונה ולאחר מכן פוחתת. לפיכך, קבועי התעריף המקביל הם בסדר גודל זהה. כדוגמה נוספת, החקירה של החליפין של מימן/דאוטריום ב-אנגיוטנסין II22 מומחש באיור 5. לאחר חשיפת דגימת אנגיוטנסין ל D2O בחדר dinec (pD2O = 10-4 mbar), דפוס איזונושא של אנגיוטנסין II הוא הרחיבה והוזז לכיוון ערכי m/z גבוה יותר המציין חילופי H על ידי אטומים. התהליך מהיר במהלך ה-60 הראשונים אך מואט באופן משמעותי במהלך הניסוי: תבנית האיזוטופ באיור 5ב’ מכסה טווח m/z רחב (כ-15 מ’/z יחידות). כאשר אנו מגדירים את דרגת הדאוד כמספר אטומי H במולקולה, הערכים של d בין d = 0 ל -d = 13 ניתנים לחילוץ מהספקטרום. באיור 5ג, תבנית האיזוטופ מופחתת שוב ברוחב. התבוננות זו יכולה להיות מיוחסת לעוצמה מופחתת בחריפות של הפסגות הקשורות לדרגות הנמוכות ביותר של הדאורות. באיור 5D, הספקטרום מוצג לזמן תגובה ארוך עוד יותר. טווח m/z המכוסה נותר כמעט זהה, אך מרכז המסה של הספקטרום עדיין משתנה לאט לקראת הגדלת ערכי m/z . לתקופות חשיפה ארוכות, חלק מהמולקולות מגיע לדרגת הדאוציה הגבוהה ביותר, dmax = 17. היא מקבילה למספר המירבי של אטומי H משני הניתנים לשינוי, שניתנו על-ידי מספר אטומי H המאוגדים לקבוצות פונקציונליות כגון חומצות קרקסיליות או קבוצות של אמין. כבר מהאבולוציה הטמפורלית של הספקטרום, ניתן להסיק כי החלפת H/D מתקיימת עם קבועי קצב שונים. לתיאור כמותי של התבוננות זו, התואר הממוצע של d̅ מותווים באיור 5E כפונקציה של זמן. בדיקת התוצאות הנסיוניות (סימנים) חושף שלושה משטרים שונים: עלייה מהירה של d̅ הפעיל עבור t < 50 s, משטר ביניים עבור 50 s < t < 200 s, ואת העלייה איטית אך כמעט רציפה עבור t > 200 s. התוצאות הנסיוניות היו מדומה בעזרת סימולציות מונטה קרלו; התגובה הראשונה מדומה, קינטיקה עם קבועי התגובה kאני הנחתי על H/D החליפין בקבוצות הפונקציונלי של המולקולות חקרו22. הסכם טוב בין סימולציות לתוצאות נסיוניות בכל שלושת המשטרים התקבל רק כאשר לפחות שלושה קבועים שיעור שונים ki עבור החליפין H/D ב אנגיוטנסין II מולקולות הוחלו. באיור 5, G, הקינטיקה כפי שהסיק מהתאמת דפוסי האיזוטופ הניסיוניים בסכום דפוסי האיזוטופ לדרגות שונות של דאורות (איור 5 לאיור 5ד) מוצגים. ההסכם הטוב בין מידע ניסיוני לבין סימולציות, כמו גם שערי חליפין שונים ביותר עבור דרגות נמוכות וגבוהות של הדאוציות, נצפו בבירור. בהשוואה לoligopeptides שונות כגון hexaglycine, שערי החליפין המהירים יוחסו לקבוצות הפונקציונליות המפורשות, בעוד ששערי החליפין האיטיים היו משויכים לקבוצות האמיד של העמוד השדרה22של הפפטיד. בעוד ששתי הדוגמאות הראשונות נמדדו בדגימות מיקרומטר-אנגיוטנסין II, איור 6 מראה את התוצאות כפי שהתקבלו מכיסוי הסאב-מונאביר של אנגיוטנסין ii על דגימות זהב כפי שהוכנו באמצעות התצהיר של הקרן החשמלית (ES-ibd)23. תלות ליניארית של עוצמת האות על כמות החומר היא נצפתה מעל 3 הזמנות של גודל, הכמות הנמוכה ביותר של חומר זוהה מתאים 0.1% של מונואולייר של אנגיוטנסין II מולקולות על משטח זהב. החלפת הניסויים המוצגת באיור 5 הוצגה גם עם אנגיוטנסין II על זהב במשטר ה-submoner23. איור 4: תצפית בזמן אמת על השפלה תרמית של אנגיוטנסין II. (א-ג) ספקטרום המסה כפי שהושג לאחר הפחתת ספיחה/אינון של האשכול ממדגם של אנגיוטנסין II. (א) דגימה טרייה בדגם RT. (ב) המחוממת עד כ-140 ° c. בנוסף לשיא ב- m/z = 1047, המשויך למולקולה המלאה [m + H]+, פסגות at m/z = 932, 1012, ו-1029 (מסומן בחצים). (ג) הפסגות האחרונות להגדיל את השיא העיקרי יורדת עם הזמן בעת שמירה על המדגם בטמפרטורה גבוהה. (ד) הנוסחה המבנית של אנגיוטנסין II המציינת את הרסיס (הסוגריים החומים) אשר מוביל להופעת הפסגה ב- m/z = 932 על ידי אובדן יחידה אחת חומצת אמינו (חומצה אספטית). (ה) תלות הזמן של הטמפרטורה לדוגמה ואת עוצמת הפסגות הראשיות המצוין במגרשים (א) ל (ג). קווים מוצקים הם מדריכים לעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: התבוננות בזמן אמת של החלפת H/D ב-אנגיוטנסין II. (A-D) ספקטרום מסה של אנגיוטנסין II כפי שהושג באמצעות DINeC-MS. בשל החלפת H/D, תבנית האיזוטופ מרחיבה ומשתנה לכיוון ערכי m/z גבוהים ב (ב) ל (ד ) בהשוואה לתבנית האיזוטופ של המינים הבלתי מדאועיים המוצגים ב (א). קווים אדומים הם נתונים, קווי מקווקו ציאן מתאימים לנתונים הנוטלים בחשבון דרגות שונות של דאוציה. (ה) דרגת ממוצע של דאוציה d̅ כפונקציה של זמן כפי שהסיק מן הניסויים (נקודות פתוחות). בנוסף, d̅ כפונקציה של זמן להסיק באמצעות סימולציות מונטה קרלו מוצג. עקומה מקווקו שחור: הדמיות הנוטלים בחשבון קבוע תעריף אחד (k1); עקום אדום: לוקח בחשבון קבועים שלושה שיעור (k1, k2, k3). (F, G) עוצמות האות היחסיות של דרגות בעלות שרות של אנגיוטנסין II (סימנים + קווים אחידים) כפונקציה של זמן יחד עם התוצאות המתאימות של סימולציות מונטה קרלו (קווים מקווקווים). דמות זו השתנתה מהפניה 22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: יישום של DINeC-MS כדי אנגיוטנסין II על הזהב במשטר submonolayer. (א) ייצוג סכמטי של השילוב של ES-ibd עבור התצהיר ו dinec-MS עבור ספקטרומטר המסה של מולקולות מבודדות אנגיוטנסין II במשטר submonolayer. (ב) התלות בעוצמת האות על חומר הכמות שהופקדו על המדגם כפי שהושג משתי ערכות בלתי תלויות של נתונים (סימנים מלאים ופתוחים). Insets: ספקטרום המסה DINeC כפי שהושג מדגימות שבהן כמות החומר הופקד כמצוין. איור זה שונה מהפניה 23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

במחקרים רבים שבוצעו עד כה, רגישות גבוהה של DINeC-MS על חומרים שונים הוכח. אכן, זה מאפשר מדידות של אנליטים עד כמות החומר במשטר הפטוole¹¹. בשל רגישות גבוהה זו, הכנה לדוגמה, ניקוי מצע מסוים, יש לבצע עם כימיקלים טהורים מאוד כדי למנוע זיהום בספקטרום המסה DINeC. כפי שהוא במקרה עבור טכניקות ניתוח רבות, מדידה הרקע המתאים ממצע ריק מסייע להפריד את הפסגות מן האנליטה ואת הפסגות אשר מקורם במצע/הכנה לדוגמה.

למרות שאנו מראים כי ההסתברות האינון של מולקולה אנליטה נתונה אינה מושפעת מאוד מנוכחות של שיתוף בייטס או שיתוף המרכיבים בדגימות מעורבות¹⁷^,²⁴, ההסתברות של אינון עשויה להשתנות מחומר לחומר¹³. לפיכך, חשוב עוד יותר לעבוד תחת תנאים נקיים כמזהמים, בהתאם להסתברות האינון שלהם, עשויים לתרום לאות הרבה יותר חזק מהאנליטה. יונים שנוצרו מראש (למשל, כפי שנמצא במקרה של מולקולות צבע רבות), או מולקולות עם קבוצות פונקציונליות אשר מציגות נטייה ברורה לקראת ספיגת פרוטון או דה-פרוטונציה (כלומר, בסיסים או חומצות), בדרך כלל להראות הסתברות יינון גבוהה ב dinec-MS. אם לא קיים קבוצה תפקודית כזאת בתוך האנליטה, הסתברות יינון יכול להיות נמוך. הדגימות ניתן לטפל על ידי סוכנים מייננת כגון חומצה trifluoro (למשל, על ידי חשיפת המדגם ללחץ האדים של הסוכן מייננת).

תוצאות הנציגים שנדונו באיור 4 ואיור 5 מדגימים את תחולתן של dinec-MS לחקירות בזמן אמת של תגובות כימיות באמצעות ספקטרומטר מסה. איור 6 ממחיש את רגישות המשנה של השיטה. אם שני המאפיינים משולבים, תגובות כימיות על משטחים והמוצרים שלהם ניתן לעקוב בזמן אמת²³. זה יכול להיות במיוחד עניין בשם “סינתזה על פני השטח” אשר מוביל הרכבה של macromolecular מבנים על משטחים³^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶. בהגדרה הנוכחית, התבוננות בתגובות משטח כזה אפשרית על משטחים עם פעילות חוזרת נמוכה כגון זהב²³ ומתכות אצילות אחרות; הניסויים קשים יותר להתבצע על משטחים תגובתי מאוד כגון משטחי סיליקון³⁷, כמו הלחץ הבסיסי בחדר desorption הוא בטווח של 10^-7-mbar-. הפעילויות הנוכחיות כתובות מגבלה זו ומנגנון DINeC תואם UHV מובנה. במקרה של משטחים תגובתי, האינטראקציה בין SO₂ ומשטח המצע צריך להיבדק לפני המדידות של משטח בייטס תגובות פני השטח.

כאשר קרן האשכול ניטראלית, היא אינה יכולה להיות ממוקדת. גודל הקורה על המדגם מוענק על ידי הגיאומטריה של הגדרת והפתח של מזרן בשימוש; ערכים טיפוסיים עבור קוטר הקרן על המדגם הוא אחד עד כמה מילימטרים. כתוצאה מכך, הדמיה על-ידי סריקת המדגם אפשרי רק עם רזולוציה נמוכה מאוד. מצד שני, בהתחשב בסבירות האינון הגבוה¹³, dinec עושה שימוש יעיל במולקולות הדסורמיטה. כך, שילוב של DINeC-MS ו-יון-דימות גלאי³⁸ נראה אטרקטיבי מאוד.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מכירים בתמיכה הפיננסית של המרכז הבינלאומי של הלמהולץ ליריד (היקופורפייר) ולבית הספר למחקר הלמהולץ עבור האדרון ומחקר היונים (נ. ב.). המחברים מודים לפרופ ‘ ראושנבאך (אוניברסיטת אוקספורד) וצוותו לשיתוף פעולה פורה בניסויים משולבים ב-ES-IBD/DINeC.

Materials

Acetone rotisolv HPLC	Roth	7328.2	HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC	Roth	p076.1	HPLC Gradient Grade
Helium	Praxair	4800086706	Purity 99.9999%
Nitrogen	Praxair	40728408	Purity 99.5 – 100%
Silicon Wafers	Active Business Company GmbH	G60007
Sulfur dioxide	Air Liquide	P1734S10R0A001	Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS	Roth	HN43.1	Ultra LC-MS

References

Vickerman, J. C., Gilmore, I. . Surface Analysis: The Principal Techniques. , (2009).
Reutzel, M., Münster, N., Lipponer, M. A., Länger, C., Höfer, U., Koert, U., Dürr, M. Chemoselective Reactivity of Bifunctional Cyclooctynes on Si(001). Journal of Physical Chemistry C. 120, 26284-26289 (2016).
Grill, L., Dyer, M., Lafferentz, L., Persson, M., Peters, M., Hecht, S. Nano-architectures by covalent assembly of molecular building blocks. Nature Nanotechnol. 2, 687-691 (2007).
Stutzmann, M., Garrido, J. A., Eickhoff, M., Brandt, M. S. Direct biofunctionalization of semiconductors: A survey. Physica Status Solidi A. 203, 3424-3437 (2006).
Adler-Abramovich, L., Gazit, E. The physical properties of supramolecular peptide assemblies: from building block association to technological applications. Chemical Society Reviews. 43, 6881-6893 (2014).
Vickerman, J. C., Briggs, D. . TOF-SIMS: Materials Analysis by Mass Spectrometry, 2nd ed. , (2013).
Winograd, N. The magic of cluster SIMS. Analytical Chemistry. 77, 142-149 (2005).
Ichiki, K., Ninomiya, S., Nakata, Y., Honda, Y., Seki, T., Aoki, T., Matsuo, J. High Sputtering Yields of Organic Compounds by Large Gas Cluster Ions. Applied Surface Science. 255, 1148-1150 (2008).
Mochiji, K., Hashinokuchi, M., Moritani, K., Toyoda, N. Matrix-free Detection of Intact Ions from Proteins in Argon-Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23, 648-652 (2009).
Yokoyama, Y., Aoyagi, S., Fujii, M., Matsuo, J., Fletcher, J. S., Lockyer, N. P., Vickerman, J. C., Passarelli, M. K., Havelund, R., Seah, M. P. Peptide Fragmentation and Surface Structural Analysis by Means of ToF-SIMS Using Large Cluster Ion Sources. Analytical Chemistry. 88, 3592-3597 (2016).
Gebhardt, C. R., Tomsic, A., Schröder, H., Durr, M., Kompa, K. L. Matrix-Free Formation of Gas-Phase Biomolecular Ions by Soft Cluster-Induced Desorption. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 4162-4165 (2009).
Baur, M., Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Durr, M. Soft Clusterinduced Desorption and Ionization of Biomolecules – Influence of Surface Load and Morphology on Desorption Efficiency. Applied Physics Letters. 99, 234103 (2011).
Lee, B. J., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Quantification of the Ionization Probability During Desorption/Ionization of Oligopeptides Induced by Neutral Cluster Impact. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 27, 1090-1094 (2013).
Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Schroder, H., Kompa, K. L., Durr, M. Observation of Ionic Desorption Channels in Cluster-induced Desorption of Alkali Halides – Influence of Surface Electronic Properties and Surface Configuration. Chemical Physics Letters. 556, 77-81 (2013).
Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact as a Soft and Efficient Ionization Source for Ion Trap Mass Spectrometry of Biomolecules. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28, 290-296 (2014).
Kley, C. S., Dette, C., Rinke, G., Patrick, C. E., Cechal, J., Jung, S. J., Baur, M., Durr, M., Rauschenbach, S., Giustino, F., Stepanow, S., Kern, K. Atomic-Scale Observation of Multiconformational Binding and Energy Level Alignment of Ruthenium-Based Photosensitizers on TiO2 Anatase. Nano Letters. 14, 563-569 (2014).
Portz, A., Aoyagi, S., Durr, M. Soft depth-profiling of mixed peptide/lipid samples by means of cluster induced desorption/ionization mass spectrometry – high depth resolution and low matrix effect. Biointerphases. 13, 03B405 (2018).
Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Frank, A. J., Neuderth, P., Eickhoff, M., Durr, M. Influence of the Cluster Constituents’ Reactivity on the Desorption/Ionization Process Induced by Neutral SO2 Clusters. Journal of Chemical Physics. 146, 134705 (2017).
Schneider, P., Durr, M. Cluster-induced desorption investigated by means of molecular dynamics simulations – Microsolvation in clusters of polar and non-polar constituents. Journal of Chemical Physics. 150, 214301 (2019).
Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10 000 Daltons. Analytical Chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90, 240-265 (2018).
Portz, A., Gebhardt, C. R., Durr, M. Real-Time Investigation of the H/D Exchange Kinetics of Porphyrins and Oligopeptides by Means of Neutral Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Journal of Physical Chemistry B. 121, 11031-11036 (2017).
Portz, A., Baur, M., Rinke, G., Abb, S., Rauschenbach, S., Kern, K., Dürr, M. Chemical Analysis of Complex Surface-Adsorbed Molecules and Their Reactions by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90, 3328 (2018).
Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Mass Spectrometry of Oligopeptides in the Presence of Large Amounts of Alkali Halides Using Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact. Biointerphases. 11, 02A316 (2016).
Shard, A. G., Spencer, S. J., Smith, S. A., Havelund, R., Gilmore, I. S. . International Journal of Mass Spectrometry. 377, 599-609 (2015).
Nakano, S., Yamagishi, T., Aoyagi, S., Portz, A., Durr, M., Iwai, H., Kawashima, T. Evaluation of Matrix Effects on TOF-SIMS Data of Leu-enkephalin and DOPC Mixed Samples. Biointerphases. 13, 03B403 (2018).
Heep, J., Tuchecker, P. H. K., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. ACS Omega. 4, 22426-22430 (2019).
Morlock, G., Schwack, W. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 29, 1157-1171 (2010).
Cheng, S. C., Huang, M. Z., Shiea, J. Thin layer chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218, 2700-2711 (2011).
Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306, 471 (2004).
Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science. 311, 1566 (2006).
Dürr, M., Gebhardt, C. Ion generation in mass spectrometers by cluster bombardment. US Patent. , (2019).
Lindner, R., Kuhnle, A. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. ChemPhysChem. 16, 1582-1592 (2015).
Dong, L., Liu, P. N., Lin, N. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. Accounts of Chemical Research. 48, 2765-2774 (2015).
Björk, J. Reaction mechanisms for on-surface synthesis of covalent nanostructures. Journal of Physics: Condensed Matter. 28, 083002 (2016).
Rauschenbach, S., Rinke, G., Gutzler, R., Abb, S., Albarghash, A., Le, D., Rahman, T. S., Durr, M., Harnau, L., Kern, K. Two-Dimensional Folding of Polypeptides into Molecular Nanostructures at Surfaces. ACS Nano. 11, 2420-2427 (2017).
Dürr, M., Höfer, U. Dissociative adsorption of molecular hydrogen on silicon surfaces. Surface Science Reports. 61, 465-526 (2006).
Zhang, J., Franzreb, K., Aksyonov, S. A., Williams, P. Mass Spectra and Yields of Intact Charged Biomolecules Ejected by Massive Cluster Impact for Bioimaging in a Time-of-Flight Secondary Ion Microscope. Analytical Chemistry. 87, 10779-10784 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Bomhardt, K., Schneider, P., Portz, A., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60487, doi:10.3791/60487 (2020).

Automatically Generated