Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Karolin Bomhardt; Pascal Schneider; Andr&#233; Portz; Christoph  R. Gebhardt; Michael D&#252;rr

doi:10.3791/60487

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Chemistry

Analyse komplexer Moleküle und ihrer Reaktionen auf Oberflächen mittels Cluster-induzierter Desorption/Ionisationsmassspektrometrie

Published: March 01, 2020

doi:

10.3791/60487

Karolin Bomhardt*¹, Pascal Schneider*¹, André Portz¹, Christoph R. Gebhardt², Michael Dürr¹

¹Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa),Justus Liebig University Giessen, ²Bruker Daltonik GmbH

Summary

Neutrale SO_2-Cluster mit niedriger kinetischer Energie (< 0,8 eV/Konstituentus) werden verwendet, um komplexe Oberflächenmoleküle wie Peptide oder Lipide zur weiteren Analyse mittels Massenspektrometrie mittels eines Ionenfallen-Massenspektrometers zu desorben. Eine spezielle Probenvorbereitung ist nicht erforderlich, und eine Echtzeitbeobachtung der Reaktionen ist möglich.

Abstract

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO₂ Clusters (DINeC) wird als sehr weiche und effiziente Desorption/Ionisationstechnik für die Massenspektrometrie (MS) komplexer Moleküle und deren Reaktionen auf Oberflächen eingesetzt. DINeC basiert auf einem Strahl von SO 2-Clustern, die sich bei geringer Clusterenergie auf die Probenoberfläche auswirken. Während des Aufpralls auf die Clusteroberfläche werden einige der Oberflächenmoleküle durch Auflösung im Aufprallcluster desorbed und ionisiert; als Ergebnis dieses auflösungsvermittelten Desorptionsmechanismus ist niedrige Clusterenergie ausreichend und der Desorptionsprozess extrem weich. Sowohl Oberflächenadsorbate als auch Moleküle, aus denen die Oberfläche besteht, können analysiert werden. Aus komplexen Molekülen wie Peptiden und Proteinen werden klare und fragmentierungsfreie Spektren gewonnen. DINeC erfordert keine spezielle Probenvorbereitung, insbesondere muss keine Matrix aufgebracht werden. Die Methode liefert quantitative Informationen über die Zusammensetzung der Proben; Moleküle mit einer Oberflächenabdeckung von nur 0,1 % einer Monoschicht nachgewiesen werden können. Oberflächenreaktionen wie H/D-Austausch oder thermische Zersetzung können in Echtzeit beobachtet und die Kinetik der Reaktionen abgeleitet werden. Mit einer gepulsten Düse für die Clusterstrahlerzeugung kann DINeC effizient mit der Ionenfallen-Massenspektrometrie kombiniert werden. Die matrixfreie und weiche Natur des DINeC-Prozesses in Kombination mit den MS^{n-Fähigkeiten} der Ionenfalle ermöglicht eine sehr detaillierte und eindeutige Analyse der chemischen Zusammensetzung komplexer organischer Proben und organischer Adsorbate auf Oberflächen.

Introduction

Oberflächenempfindliche Analysetechniken basieren häufig auf Partikelsonden wie Energiearmelektronen, Atomen oder Ionen, die stark mit festen Proben interagieren. Infolgedessen zeigen sie eine hohe Oberflächenempfindlichkeit und detaillierte Informationen über die Oberflächenstruktur können erhalten werden¹. Chemische Informationen sind jedoch oft begrenzt. Beispielsweise kann die Röntgenphotoelektronenspektroskopie quantitative Informationen über die atomare Zusammensetzung und die durchschnittliche chemische Umgebung einer bestimmten Spezies geben (z. B. die Kohlenstoffatome in einem organischen Molekül, das auf einer Oberfläche adsorbiert wird²). Detailliertere Informationen über komplexe, oberflächenadsorbierende Moleküle, wie z. B. deren detaillierte Struktur oder Bindungsstellen, lassen sich jedoch mit Standard-Oberflächenanalyseverfahren nur schwer erhalten. Andererseits wächst der Bedarf an solchen Informationen mit dem wachsenden Interesse an Oberflächenfunktionalisierung mittels organischer Moleküle. Die sich ausdehnenden Felder der Oberflächensynthese³ oder der Oberflächenfunktionalisierung durch Anhaftung von Biomolekülen⁴^,⁵ sind zwei prominente Beispiele. In all diesen Bereichen werden grundlegende Fragen zu Substratadsorbat- und Adsorbat-Adsorbat-Interaktionen untersucht, um die Systeme besser zu verstehen. Für diese Untersuchungen ist ein Maximum an Informationen über die adsorbten Moleküle wünschenswert.

Teilweise kann die sekundäre Ionenmassenspektrometrie (SIMS) solche Informationen geben. Erstens ist SIMS hochgradig oberflächenempfindlich. Zweitens: Da die sputterten Adsorbate und ihre Fragmente mittels MS erkannt werden, werden Informationen erhalten, die weit über die atomare Zusammensetzung hinausgehen. Je nach Art der an der Oberfläche adsorbierten chemischen Spezies kann sie durch ihre molekulare Masse und ihr Fragmentmuster identifiziert werden, das im Massenspektrum⁶beobachtet wird. Die durch die Primärionen induzierten Fragmente können in der Tat zur Identifizierung des analysierten Materials beitragen. Wenn andererseits die Primärionen-induzierte Modifikation (Fragmentierung, Ionen-induzierte Reaktionen, Mischen) der Probe zu stark ist, gehen die meisten Informationen über den ursprünglichen Zustand der Probe verloren. Daher wurden große Anstrengungen unternommen, um die Fragmentierung von SIMS zu reduzieren (z. B. unter Verwendung geladener molekularer Cluster als Primärionen⁷^,⁸^,⁹). Die Fragmentierung dominiert jedoch nach wie vor SIMS-Spektren großer Makromoleküle und biologischer Proben¹⁰, wodurch die Anwendung von SIMS in verschiedenen Bereichen eingeschränkt wird.

Als Alternative haben wir gezeigt, dass die durch neutrale Cluster (DINeC) induzierte Desorption/Ionisierung eine weiche und matrixfreie Ionisationsmethode ist, die erfolgreich für die massenspektrometrische Analyse komplexer Moleküle¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷eingesetzt wurde. DINeC basiert auf einem Strahl molekularer Cluster, die aus 10³ bis 10⁴ SO₂ Molekülen bestehen (Abbildung 1). Wenn die Cluster auswirkungen auf die Probe, interagieren sie auf verschiedene Weise mit den Molekülen auf und in der Oberfläche: Erstens wird ein Teil der kinetischen Energie des Clusters neu verteilt und aktiviert desorption. Ähnlich wichtig ist, dass das desorbing Molekül im Cluster während des Cluster-Oberflächenaufpralls¹¹^,¹⁸^,¹⁹ ( Abbildung1 und Abbildung 2) gelöst wird. Mit anderen Worten, basierend auf dem hohen Dipolmoment von SO₂dienen die Cluster sehr effizient als transiente Matrix für polare Analyten. Infolgedessen erfolgt die Desorption der Analytmoleküle bei Clusterenergien bis zu 1 eV/Molekül und darunter. Die weiche Natur des Desorptionsprozesses wird durch eine schnelle Kühlung des Systems weiter unterstützt, wenn der SO_2-Cluster während und nach dem Aufprall auf der Oberfläche zerbricht¹¹^,¹⁹. Als Folge dieser verschiedenen Aspekte verläuft die Cluster-induzierte Desorption komplexer Moleküle wie Peptide, Proteine, Lipide und Farbstoffe ohne Fragmentierung der desorbing-Moleküle¹¹^,¹⁵; typische Massenspektren zeigen den dominanten Peak beim m/z-Wert des intakten Moleküls ([M+H]⁺ oder [M-H]^– , Abbildung 3). Je nach Anzahl und Art der funktionellen Gruppen im Molekül werden mehrere geladene Kationen der Form [M + n H]ⁿ⁺ werden^{beobachtet 11}^,¹⁵^,¹⁸. Bei Biomolekülen erfolgt die Ionisation in der Regel über die Aufnahme oder Abstraktion eines Protons in einer basis- bzw. sauren funktionellen Gruppe bzw.¹¹. Wenn Wassermoleküle in der Probe vorhanden sind, können SO₂ Moleküle aus dem Cluster mit diesen Wassermolekülen reagieren, die Schwefelsäure^{bilden 18}. Letzteres kann als effiziente Protonenquelle fungieren, die den Ionisationsprozess bei Ionisation über Protonenaufnahme (positiver Ionenmodus) weiter fördert¹³^,¹⁸.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Cluster-induzierten Desorption/Ionisierung und des experimentellen Aufbaus. Cluster-induzierte Desorption/Ionisierung wird in einem Hochvakuumgefäß durchgeführt. Ein Strahl von SO_2-Clustern (gelbe Punkte) wird durch Überschallausdehnung eines SO₂/He-Gasgemischs aus einer gepulsten Düse erzeugt. Während des Aufpralls auf die Clusteroberfläche werden Oberflächenmoleküle desorbed und ionisiert. Molekulare Ionen (rote/orange Punkte) werden über ein voreingenommenes Gitter, einen Dual-Ionen-Trichtereinlass und oktopolare Ionenführungen in die Ionenfalle für die Massenspektrometrie übertragen. Typische Massenspektren zeigen dominante Spitzen bei m/z-Werten der intakten Moleküle, hier: M1 (orange) und M2 (rot) im positiven Ionenmodus. Aufblasen: Bei der Aufprallaufschlagsaufebene werden die desorbeden Moleküle im Aufprallhaufen oder in einem seiner Fragmente gelöst. Weitere Zersplitterung und Verdunstung von SO_2-Molekülen führen dann zu dem nackten, intakten molekularen Ionen, wie es im Massenspektrometer nachgewiesen wird. Siehe auch Abbildung 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Snapshots molekularer Dynamiksimulationen zur Veranschaulichung der Cluster-induzierten Desorption durch Auflösung. (A) Ein SO_2-Cluster (300 Moleküle) nähert sich der Oberfläche mit 1250 m/s s senkrecht zur Oberfläche, auf der ein Dipeptid (Aspartinsäure-Arginin, ASP-ARG) adsorbiert wird. (B) Bei der Einschlagsfläche von Clusteroberfläche zerbricht der Cluster. Das adsorbierte Dipeptid interagiert mit den umgebenden SO 2-Molekülen, was zu seiner Auflösung in einem der Clusterfragmente führt. (C) Die Clusterfragmente werden von der Oberfläche abgestoßen. Das beschriftete Fragment (blauer Kreis) trägt das Dipeptid, das in diesem Fragment desorbed ist. Diese Zahl wurde von Bezug 19 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentatives Massenspektrum und molekulares Modell von Angiotensin II. (A) Massenspektren (oberes Panel: positiver Ionenmodus, unteres Panel: negativer Ionenmodus), wie es nach clusterinduzierter Desorption/Ionisierung aus einer Angiotensin-II-Probe erzielt wurde. Die Probe wurde durch Tropfengießen der jeweiligen Lösung auf einem Si-Wafer (bedeckt mit seinem natürlichen Oxid) hergestellt. Die Hauptspitzen sind dem intakten Biomolekül [M+H]⁺ und [M-H]^{zugeordnet –}; es werden keine Fragmentierungsmuster beobachtet. Dimere ([2M+H]⁺, Pfeil) zeigen weiter die weiche Natur des Desorptionsprozesses an. Das positive Ionensignal ist aufgrund des Einflusses der SO_2-Cluster ¹⁸intensiver. (B) Raumfüllendes Modell und Aminosäuresequenz von Angiotensin II. Weiße Kugeln zeigen Wasserstoffatome an; schwarz: Kohlenstoff; blau: Stickstoff; rot: Sauerstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DINeC kann auf jede Art von festen Proben angewendet werden, die mit Hochvakuumbedingungen kompatibel sind. Eine spezielle Probenvorbereitung ist nicht erforderlich, insbesondere darf vor DINeC-MS-Messungen keine Matrix angewendet werden, im Gegensatz zur matrixgestützten Laserdesorption/Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie und verwandten Techniken²⁰^,²¹. Dies ermöglicht Echtzeitmessungen chemischer Veränderungen der Probe mit unterschiedlichen Versuchsbedingungen wie Hintergrunddruck reaktiver Arten in der Vakuumkammer²² oder Probentemperatur. Die Nachweisgrenze von DINeC-MS liegt nachweislich im Femtomol-Bereich¹¹. Bei der Anwendung auf die Analyse von Biomolekülen, die auf festen Oberflächen im Submonolayer-Regime adsorbiert wurden, wurde eine Oberflächenabdeckung von nur 0,1 % einer Monoschicht²³festgestellt. In diesem Abdeckungsschema hängt die Signalintensität linear von der Oberflächenabdeckung ab und DINeC-MS kann für die quantitative Analyse der Oberflächenzusammensetzung²³verwendet werden. Bei gemischten Proben ist eine quantitative Auswertung der Probenzusammensetzung¹⁷^,²⁴möglich, da keine wesentlichen Auswirkungen der chemischen Umgebung auf die Ionisationswahrscheinlichkeit beobachtet werden (z.B. bei gemischten Lipid-/Peptidproben¹⁷). Dies steht in deutlichem Gegensatz zu SIMS, bei dem die Ionisationswahrscheinlichkeit einer bestimmten Art typischerweise stark durch das Vorhandensein verschiedener chemischer Komponenten (der sogenannte “Matrixeffekt”²⁵^,²⁶) beeinflusst wird.

Neben der Oberflächenanalyse kann die chemische Zusammensetzung im Untergrundbereich mittels Tiefenprofilierung¹⁷untersucht werden. Bei der aktuellen Einrichtung sind die typischen Desorptionsraten der Cluster-induzierten Desorption von Biomolekülen in der Größenordnung von 10^-3 nm/s. Bei gemischten Lipid-/Peptidproben wurde eine hohe Tiefenauflösung im Bereich von 1 bis 2 nm beobachtet¹⁷.

Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Kombination von DINeC-MS mit Dünnschichtchromatographie (TLC). Herkömmliche TLC-Platten können mit Hilfe von DINeC-MS direkt analysiert werden. Positionsabhängige Massenspektren können von den TLC-Platten erfasst und somit massenspezifische Chromatogramme aus den TLC-Platten²⁷bezogen werden. Eine Nachelution der getrennten Analyten ist nicht erforderlich, anders als TLC in Kombination mit ESI²⁸^,²⁹. Auch für die DINeC-MS + TLC-Kombination ist keine Matrix erforderlich, im Gegensatz zur Kopplung von TLC mit MALDI²⁸^,²⁹.

Desorption Elektrospray-Ionisation (DESI) ist auch eine weiche Desorption/Ionisationsmethode für MS-Anwendungen³⁰^,³¹. Die auffälligsten Unterschiede zwischen DINeC und DESI sind: die quantitative Natur von DINeC²³, seine Kompatibilität mit Ultra-Hochvakuum (UHV) Bedingungen, insbesondere die Möglichkeit, Proben zu untersuchen, die unter UHV-Bedingungen hergestellt und übertragen werden, ohne das Vakuum zu brechen²³, sowie die Möglichkeit, unpolare Moleküle effizient zu desorbieren¹⁹.

Grundsätzlich kann DINeC als Desorptions-/Ionisationsquelle an jede Art von Massenspektrometer gekoppelt werden. Die Kombination mit der Ionenfallen-Massenspektrometrie weist jedoch zwei Hauptvorteile auf: Erstens entsprechen die Pulsbreite und Wiederholungsrate eines typischen gepulsten Clusterstrahls sehr gut der diskontinuierlichen Akkumulationszeit sowie der Spektralrate der Ionenfalle¹⁵^,³². Zweitens führt die weiche Natur des DINeC-Prozesses zur Desorption intakter Moleküle. In Kombination mit den MS^{n-Fähigkeiten} der Ionenfallen-Massenspektrometrie ermöglicht dies eine möglichst umfassende Analyse der untersuchten Proben¹⁵.

Protocol

HINWEIS: Das Protokoll kann jederzeit angehalten werden. 1. Herstellung von Substraten Für Standardproben die Substrate aus Siliziumwafern (Dicke ca. 0,5 bis 1 mm) in Stücke von 1 x 1 cm2schneiden. Reinigen Sie die Si-Substrate in einem Ultraschallbad mit Ethanol und Aceton für jeweils 15 min. Trocknen Sie die Substrate in einem Strom von trockenem Stickstoffgas. 2. Vorbereitung von Proben Standard-Probenvorbereitung Bereiten Sie für Standardproben die Lösung vor, die die Analytmoleküle enthält, entsprechend der zu behandelnden wissenschaftlichen Frage. Die Konzentration des Analyten sollte mindestens 1 x 10-10 mol/L betragen. Tropfengegossen 5 bis 30 l der Probenlösung auf dem Substrat. Lassen Sie die Probe je nach Dampfdruck des Lösungsmittels unter Umgebungsbedingungen oder in einem Trockenhaus trocknen, bis das gesamte Lösungsmittel verdampft und ein Trockenfilm gebildet wurde. Je nach der menge der angewendeten Substanz kann die Dicke des Films zwischen mehreren zehn m (visuelle Inspektion möglich) und der Monoschicht bis zum Submonolayer-Regime liegen (also nicht mit dem Auge nachweisbar). Montieren Sie die Proben auf dem Probenhalter (z. B. mit Klebeband oder Klemmen, die je nach den erforderlichen Proben und Vakuumbedingungen mit Schrauben angezogen werden). Wenn möglich, montieren Sie zusätzlich eine Referenzprobe wie einen mikrometerdicken Film von Angiotensin II auf dem Probenhalter. Alternative Probenvorbereitung Verwenden Sie alternative Probenvorbereitungsschemata wie Elektrospray-Ionenstrahl-Abscheidung (ES-IBD) in Vakuum- oder Dip-Beschichtung in einer entsprechenden Lösung, falls zutreffend. Proben montieren, die vor den Vorbereitungsschritten im Vakuum auf den DINeC-Probenhalter vorbereitet und übertragen werden sollen. Stellen Sie sicher, dass die dip-beschichteten Proben nach dem letzten Vorbereitungsschritt trocken sind. Betrachten Sie das einfachste Vorbereitungsschema. Zum Beispiel, für die Untersuchung von Highlighter-Tinte, zeichnen Sie einfach einen Punkt auf der Substratoberfläche. 3. Übertragung von Proben in das DINeC-Massenspektrometer Übertragung von Proben aus Umgebungsbedingungen in die evakuierte DINeC-Kammer Entlüften Sie das Lastsperrsystem. Öffnen Sie das Lastschloss und montieren Sie den Probenhalter. Schließen Sie das Lastschloss und pumpen Sie die Lastsperrkammer auf einen Druck unter 2 x 10-5 mbar. Öffnen Sie das Ventil zur DINeC-Kammer und übertragen Sie den Probenhalter mit dem Transferstab zum Hauptmanipulator. Befestigen Sie den Probenhalter am Manipulator. Ziehen Sie die Transferstange ein und schließen Sie das Ventil zwischen Lastschloss und DINeC-Kammer. Übertragung von Proben aus dem Vakuum in die evakuierte DINeC-Kammer Verwenden Sie einen transportablen Vakuumbehälter, der am CF40-Flansch der DINeC-Kammer befestigt werden kann. Übertragen Sie die Proben, die im Vakuum vorbereitet wurden, mit diesem Behälter, ohne das Vakuum zu brechen. Stellen Sie sicher, dass die Proben auf einem Probenhalter montiert sind, der mit dem im DINeC-System verwendeten Manipulator kompatibel ist. Befestigen Sie den transportablen Vakuumbehälter am CF40-Flansch und pumpen Sie das Volumen zwischen Behälter und DINeC-Kammer nach unten. Sobald der Druck unter 2 x 10-5 mbar gefallen ist, öffnen Sie die Torventile zur DINeC-Kammer und den transportablen Vakuumbehälter und übertragen Sie die Probe mit einem Wackelstab oder einem anderen Transfersystem mit mehr als 50 cm linearer Bewegung in die DINeC-Kammer. Ziehen Sie das Transfersystem zurück und schließen Sie die beiden Torventile. 4. Herstellung von Gasgemisch Bereiten Sie ein Gemisch von ca. 3% SO2 in Helium vor, indem Sie zunächst die Gasflaschen des Gasmischsystems für 10 min evakuieren. Füllen Sie die Zylinder mit SO2, bis ein Druck von 1 bar erreicht ist. Füllen Sie die Zylinder weiter mit Helium, bis ein Gesamtdruck von 30 bar erreicht ist.VORSICHT: Bei verwendung von SO2sind die jeweiligen Sicherheitsvorkehrungen wie die Lagerung von SO2-Zylindern in ausgewiesenen Gasschränken stets zu erfüllen. 5. Vorbereitung des DINeC-Massenspektrometers Öffnen Sie das Ventil zwischen gaszylinder und düse. Stellen Sie den Druck des SO2/He-Gasgemisches an der Umrisslinie des Gasmischsystems auf 15 bar ein. Legen Sie die Position des Manipulators auf die Position des Referenzbeispiels fest. Stellen Sie für die Messung kationischer Massenspektren die Vorspannung der Probe und des Rasters auf +40 bzw. +7 V ein. Um die gepulste Düse und das Ionenfang-Massenspektrometer anzutreiben, stellen Sie den externen Funktionsgenerator auf 2 Hz ein. Stellen Siemit dem Verzögerungsgenerator die Zeitverzögerung n zwischen dem Clear Trap Signal aus der Ionenfalle und dem Triggersignal für die gepulste Düse auf 5 ms ein. Passen Sie in der Steuerungssoftware die folgenden Parameter an, indem Sie die entsprechenden Tasten drücken oder die entsprechenden Werte in der Modeseite des Hauptdialogfensters eingeben: Scan-Modus: Verbesserte Auflösung, Bereich: m/z 50 – 3000, Accu-Time: 0,1 ms, Durchschnitt: 10 Zyklen, Polarität: positiv für die Messung kationischer MassenspektrenHINWEIS: Zur Messung von anionischen Spektren müssen die Proben- und Rasterneigung in Bezug auf Masse negativ sein, Polarität muss in der Steuerungssoftware auf Negativ umgestellt werden. 6. Messung von Massenspektren Sobald ein Druck unter 3 x 10-6 mbar in der DINeC-Kammer erreicht ist, kann die Messung gestartet werden. Starten Sie die Messung, indem Sie zuerst Stand by drücken und dann in der Steuerungssoftware operate drücken. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Messungen und drücken Sie die Play-Taste. Messen Sie ein Testspektrum aus einer Referenzprobe wie Angiotensin II für ca. 300 s. Folgen Sie der Zeitabhängigkeit des Signals mit dem auf den jeweiligen m/z-Wert gesetzten Chromatogramm. Optimieren Sie die Signalintensität durch Einstellung der Zeitverzögerungn zwischen dem Clear Trap Signal und dem Signal, das die gepulste Düse auslöst. Bewegen Sie den Manipulator an die Position der zu messenden Probe. Optimieren Sie die Signalintensität durch Einstellung der Probenposition innerhalb der Probenhalterebene. Erwerben Sie Massenspektren über die Zeitspanne von Interesse. Ändern Sie die experimentellen Parameter wie Probentemperatur oder Hintergrunddruck in der Kammer entsprechend den Details des Experiments. Nehmen Sie weiterhin Massenspektren ein, wenn Sie die experimentellen Parameter variieren. 7. Datenauswertung Laden Sie nach Abschluss der Messung den jeweiligen Datensatz in das Datenanalyseprogramm. Wählen Sie die Zeitspanne des Interesses für das Chromatogramm mit der rechten Maustaste aus. Das gemittelte Spektrum wird in einem separaten Fenster angezeigt. Exportieren Sie das Spektrum als Datendatei zur weiteren Verarbeitung in einem Programm ihrer Wahl.

Representative Results

Im Folgenden werden zwei Beispiele für die Echtzeitanwendung von DINeC-MS vorgestellt. Abbildung 4 zeigt die Veränderung des Massenspektrums aus Angiotensin II, wenn die Probe auf ca. 140 °C erhitzt wird. Wenn die Endtemperatur erreicht ist (Abbildung 4B, Abbildung 4E), wird das Spektrum durch einen zusätzlichen Peak gekennzeichnet, der den Verlust einesH2O-Gestelles angibt (m/z = 1029). Bei der Aufnahme bei dieser Temperatur wird eine weitere Zersetzung der Angiotensin-II-Moleküle beobachtet (Abbildung 4C), einschließlich des Verlustes einer der terminalen Aminosäureeinheiten, Aspartinsäure (Spitze bei m/z = 932, Abbildung 4D). Die quantitative Analyse der Daten ermöglicht die Auswertung der zugrunde liegenden Reaktionskinetik (Abbildung 4E). Insbesondere zeigt Abbildung 4E, dass das Gebilde mit m/z = 1029 ein Zwischenprodukt ist, das sich weiter in kleinere Fragmente zerlegt, wenn die Intensität zuerst zunimmt und dann abnimmt. Die gleichzeitigen Ratenkonstanten liegen somit in der gleichen Größenordnung. Als zweites Beispiel ist die Untersuchung des Wasserstoff-Deuterium-Austauschs in Angiotensin II22 in Abbildung 5dargestellt. Bei Exposition der Angiotensinprobe mitD2O in der DINeC-Kammer (pD2O = 10-4 mbar) wird das Isotopenmuster von Angiotensin II erweitert und auf höhere m/z-Werte verschoben, die den Austausch von H durch D-Atome anzeigen. Der Prozess ist in den ersten 60 s schnell, verlangsamt sich aber im weiteren Verlauf des Experiments deutlich: Das Isotopenmuster in Abbildung 5B deckt einen weiten m/z-Bereich ab (ca. 15 m/z Einheiten). Wenn wir den Deuterationsgrad d als die Anzahl der ausgetauschten H-Atome in einem Molekül definieren, können Werte von d zwischen d = 0 bis d = 13 aus dem Spektrum extrahiert werden. In Abbildung 5Cwird das Isotopenmuster erneut in der Breite reduziert. Diese Beobachtung ist auf die stark reduzierte Intensität der Spitzen zurückzuführen, die mit den niedrigsten Deuterationsgraden verbunden sind. In Abbildung 5Dwird das Spektrum für noch längere Reaktionszeiten dargestellt. Der abgedeckte m/z-Bereich bleibt fast gleich, aber der Massenmittelpunkt des Spektrums verschiebt sich immer noch langsam in Richtung steigender m/z-Werte. Bei langen Belichtungszeiten erreicht ein Teil der Moleküle den höchsten Deuterationsgrad, dmax = 17. Es entspricht der maximalen Anzahl austauschbarer H-Atome, die durch die Anzahl der H-Atome angegeben wird, die an funktionelle Gruppen wie Carbonsäuren oder Amingruppen gebunden sind. Schon aus der zeitlichen Entwicklung der Spektren lässt sich ableiten, dass der H/D-Austausch mit unterschiedlichen Kurskonstanten stattfindet. Für eine quantitative Beschreibung dieser Beobachtung wird in Abbildung 5E als Funktion der Zeit der mittlere Deuterationsgrad d’ dargestellt. Die Untersuchung der Experimentellen Ergebnisse (Symbole) zeigt drei verschiedene Regime: eine schnelle Zunahme von d’ operative für t < 50 s, ein Zwischenregime für 50 s < t < 200 s, und eine langsame, aber fast kontinuierliche Zunahme für t > 200 s. Die experimentellen Ergebnisse wurden mit Hilfe von Monte-Carlo-Simulationen simuliert; Pseudo-Erstordnungsreaktionskinetik mit Reaktionskonstanten ki wurde für den H/D-Austausch an den funktionellen Gruppen der untersuchten Moleküle angenommen22. Eine gute Übereinstimmung zwischen Simulationen und experimentellen Ergebnissen in allen drei Regimen wurde nur erzielt, wenn mindestens drei verschiedene Ratenkonstanten ki für den H/D-Austausch in Angiotensin-II-Molekülen angewendet wurden. In Abbildung 5F,Gwerden die Kinetik, wie sie aus der Anpassung der experimentellen Isotopenmuster durch die Summe der Isotopenmuster für verschiedene Deuterationsgrade abgeleitet wird (Abbildung 5A bis Abbildung 5D), dargestellt. Die gute Übereinstimmung zwischen experimentellen Daten und Simulationen sowie die sehr unterschiedlichen Wechselkurse für niedrige und hohe Deuterationen werden deutlich beobachtet. Im Vergleich zu verschiedenen Oligopeptiden wie Hexaglycin wurden die schnellen Wechselkurse den expliziten funktionellen Gruppen zugeschrieben, während die langsamen Wechselkurse mit den Amidgruppen des Peptid-Rückgrats22assoziiert wurden. Während diese ersten beiden Beispiele mit mikrometerdicken Angiotensin-II-Proben gemessen wurden, zeigt Abbildung 6 die Ergebnisse, die aus der submonoschichten Abdeckung von Angiotensin II auf Goldproben gewonnen wurden, die mittels Elektrospray-Ionen-Strahlabscheidung (ES-IBD)23hergestellt wurden. Eine lineare Abhängigkeit der Signalintensität von der Substanzmenge wird über 3 Größenordnungen beobachtet, die niedrigste nachgewiesene Substanzmenge entspricht 0,1% einer Monoschicht von Angiotensin-II-Molekülen auf der Goldoberfläche. H/D-Austauschexperimente, wie in Abbildung 5 dargestellt, wurden auch mit Angiotensin II auf Gold im Submonolayer-Regime23durchgeführt. Abbildung 4: Echtzeitbeobachtung des thermischen Abbaus von Angiotensin II. (A-C) Massenspektren, die nach clusterinduzierter Desorption/Ionisierung aus einer Angiotensin-II-Probe gewonnen wurden. (A) Frische Probe bei RT. (B) Probe erhitzt auf ca. 140 °C. Zusätzlich zum Peak bei m/z = 1047, der mit dem intakten Molekül [M+H]+assoziiert ist, erscheinen Spitzen bei m/z = 932, 1012 und 1029 (durch Pfeile angezeigt). (C) Die letztgenannten Spitzen nehmen zu, und der Hauptgipfel nimmt mit der Zeit ab, wenn die Probe bei erhöhter Temperatur gehalten wird. (D) Strukturformel von Angiotensin II, die das Fragment (braune Klammern) anzeigt, was zum Auftreten des Peaks bei m/z = 932 durch Verlust einer Aminosäureeinheit (Assigsäure) führt. (E) Zeitliche Abhängigkeit der Probentemperatur und der Intensität der in den Parzellen (A) bis (C) angegebenen Hauptspitzen. Durchgezogene Linien sind Führungen zum Auge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Echtzeitbeobachtung des H/D-Austauschs in Angiotensin II. (A-D) Kationische Massenspektren von Angiotensin II, die mittels DINeC-MS gewonnen werden. Durch den H/D-Austausch erweitert sich das Isotopenmuster und verschiebt sich im Vergleich zum Isotopenmuster der in (A)dargestellten Sorzart in Richtung höherer m/z-Werte in (B) bis (D). Rote Linien sind Daten, gestrichelte Cyan-Linien passen zu den Daten unter Berücksichtigung unterschiedlicher Deuterationsgrade. (E) Durchschnittlicher Deuterationsgrad d’ in Abhängigkeit von der Zeit, wie sie aus den Experimenten abgeleitet wird (offene Punkte). Darüber hinaus wird d’ als Funktion der Zeit, die mit Hilfe von Monte-Carlo-Simulationen abgeleitet wird, angezeigt. Schwarze gestrichelte Kurve: Simulationen unter Berücksichtigung einer Ratenkonstante (k1); rote Kurve: unter Berücksichtigung von drei Ratenkonstanten (k1, k2, k3). (F,G) Relative Signalintensitäten ausgewählter Deuterationsgrade von Angiotensin II (Symbole + durchgezogene Linien) in Abhängigkeit von der Zeit zusammen mit den entsprechenden Ergebnissen der Monte-Carlo-Simulationen (gestrichelte Linien). Diese Zahl wurde von Bezug 22 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Anwendung von DINeC-MS auf Angiotensin II auf Gold im Submonolayer-Regime. (A) Schematische Darstellung der Kombination von ES-IBD zur Abscheidung und DINeC-MS für die Massenspektrometrie isolierter Angiotensin-II-Moleküle im Submonolayer-Regime. (B) Abhängigkeit der Signalintensität von der auf der Probe abgelagerten Menge Stoff, die aus zwei unabhängigen Datensätzen (gefüllte und offene Symbole) gewonnen wird. Insets: DINeC-Massenspektren, die aus Proben gewonnen wurden, auf denen sich wie angegeben eine Menge Substanz ablagerte. Diese Zahl wurde von Bezug 23 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

In vielen bisher durchgeführten Studien wurde eine hohe Empfindlichkeit von DINeC-MS für verschiedene Substanzen nachgewiesen. Dies ermöglicht Messungen von Analyten bis zu einer Menge Substanz im Femtomol-Regime¹¹. Aufgrund dieser hohen Empfindlichkeit muss die Probenvorbereitung, insbesondere die Substratreinigung, mit hochreinen Chemikalien durchgeführt werden, um eine Kontamination in den DINeC-Massenspektren zu vermeiden. Wie bei vielen Analysetechniken hilft eine korrekte Hintergrundmessung von einem leeren Substrat, Spitzen und Spitzen, die ihren Ursprung in der Substrat-/Probenvorbereitung haben, zu trennen.

Obwohl wir gezeigt haben, dass die Ionisationswahrscheinlichkeit eines bestimmten Analytenmoleküls nicht stark durch das Vorhandensein von Mitadsorbaten oder Kokonstituenten in gemischten Proben¹⁷^,²⁴beeinflusst wird, kann die Ionisationswahrscheinlichkeit von Substanz zu Substanz¹³variieren. Daher ist es noch wichtiger, unter sauberen Bedingungen zu arbeiten, da Verunreinigungen, abhängig von ihrer Ionisationswahrscheinlichkeit, zu dem Signal beitragen können, das viel stärker ist als der Analyt. Vorgeformte Ionen (z. B. bei vielen Farbstoffmolekülen) oder Moleküle mit funktionellen Gruppen, die eine deutliche Tendenz zur Protonenaufnahme oder -deprotonation (z. B. Basen oder Säuren) aufweisen, weisen typischerweise eine hohe Ionisationswahrscheinlichkeit bei DINeC-MS auf. Wenn keine solche funktionelle Gruppe im Analyten vorhanden ist, kann die Ionisationswahrscheinlichkeit gering sein. Die Proben können dann mit ionisierenden Mitteln wie Trifluorsäure behandelt werden (z. B. durch Exposition der Probe gegenüber dem Dampfdruck des Ionismittels).

Die in Abbildung 4 und Abbildung 5 erörterten repräsentativen Ergebnisse zeigen die Anwendbarkeit von DINeC-MS für Echtzeituntersuchungen chemischer Reaktionen mittels Massenspektrometrie. Abbildung 6 zeigt die Submonolayer-Empfindlichkeit der Methode. Wenn die beiden Eigenschaften kombiniert werden, können chemische Reaktionen auf Oberflächen und deren Produkte in Echtzeit verfolgt werden²³. Dies kann insbesondere für die sogenannte “On-Surface-Synthese” von Interesse sein, die zur Montage makromolekularer Strukturen auf den Oberflächen³^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶führt. Im aktuellen Aufbau ist die Beobachtung solcher Oberflächenreaktionen auf Oberflächen mit geringerer Reaktivität wie Gold²³ und anderen Edelmetallen möglich; Die Experimente sind schwieriger auf hochreaktiven Oberflächen wie Siliziumoberflächen³⁷durchzuführen, da sich der Grunddruck in der Desorptionskammer im 10^{-7-mbar-Bereich}befindet. Aktuelle Aktivitäten befassen sich mit dieser Einschränkung und ein UHV-kompatibles DINeC-Gerät wird aufgebaut. Bei reaktiven Oberflächen muss die Wechselwirkung zwischen SO₂ und der Substratoberfläche vor den Messungen von Oberflächenadsorbaten und Oberflächenreaktionen getestet werden.

Da der Clusterstrahl neutral ist, kann er nicht fokussiert werden. Die Strahlgröße auf der Probe wird somit durch die Geometrie des Aufbaus und der Öffnung des in Gebrauch enthoben Abschäumers angegeben; typische Werte für den Strahldurchmesser auf der Probe sind ein bis mehrere Millimeter. Daher ist die Bildgebung durch Scannen der Probe nur mit sehr geringer Auflösung möglich. Auf der anderen Seite, gegeben durch die hohe Ionisationswahrscheinlichkeit^13,diNeC effizient nutzt die desorbed Moleküle. Daher scheint eine Kombination aus DINeC-MS und einem Ionen-Bild-Detektor³⁸ sehr attraktiv zu sein.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung des Helmholtz International Center for FAIR (HICforFAIR) und der Helmholtz Graduate School for Hadron and Ion Research (P.S.). Die Autoren danken Prof. Rauschenbach (Universität Oxford) und seinem Team für die fruchtbare Zusammenarbeit bei kombinierten ES-IBD/DINeC-Experimenten.

Materials

Acetone rotisolv HPLC	Roth	7328.2	HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC	Roth	p076.1	HPLC Gradient Grade
Helium	Praxair	4800086706	Purity 99.9999%
Nitrogen	Praxair	40728408	Purity 99.5 – 100%
Silicon Wafers	Active Business Company GmbH	G60007
Sulfur dioxide	Air Liquide	P1734S10R0A001	Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS	Roth	HN43.1	Ultra LC-MS

References

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Bomhardt, K., Schneider, P., Portz, A., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60487, doi:10.3791/60487 (2020).

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