Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Karolin Bomhardt; Pascal Schneider; Andr&#233; Portz; Christoph  R. Gebhardt; Michael D&#252;rr

doi:10.3791/60487

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

تحليل الجزيئات المعقدة وردود أفعالها على الأسطح عن طريق الامتصاص/التأيّن الطيفي الكتلي الناجم عن الكتلة

Published: March 01, 2020

doi:

10.3791/60487

Karolin Bomhardt*¹, Pascal Schneider*¹, André Portz¹, Christoph R. Gebhardt², Michael Dürr¹

¹Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa),Justus Liebig University Giessen, ²Bruker Daltonik GmbH

Summary

وتستخدم مجموعات محايدة SO₂ من الطاقة الحركية المنخفضة (< 0.8 eV/constituent) لdesorb جزيئات السطح المعقدة مثل الببتيدات أو الدهون لمزيد من التحليل عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام مطياف كتلة فخ أيون. لا يلزم إعداد عينة خاصة ، ومراقبة ردود الفعل في الوقت الحقيقي أمر ممكن.

Abstract

يستخدم الإمتزاز/التأين الناجم عن مجموعات SO₂ المحايدة (DINeC) كتقنية استمتلاك/تأين ناعمة وفعالة للغاية لقياس الطيف الكتلي (MS) للجزيئات المعقدة وردود أفعالها على الأسطح. ويستند DINeC على شعاع من مجموعات SO₂ التي تؤثر على سطح العينة في طاقة الكتلة المنخفضة. أثناء ارتطام سطح الكتلة، يتم تجريد بعض الجزيئات السطحية وتأينها عن طريق الذوبان في المجموعة المؤثرة؛ ونتيجة لهذه الآلية التي تتوسط في الذوبان، فإن الطاقة المنخفضة للكتلة كافية وعملية الامتزاز لينة للغاية. يمكن تحليل كل من الامتصاصات السطحية والجزيئات التي يتكون منها السطح. يتم الحصول على أطياف واضحة وخالية من التجزؤ من الجزيئات المعقدة مثل الببتيدات والبروتينات. لا يتطلب DINeC أي إعداد عينة خاصة ، ولا سيما لا يجب تطبيق أي مصفوفة. وتسفر هذه الطريقة عن معلومات كمية عن تكوين العينات؛ يمكن الكشف عن جزيئات في تغطية سطحية منخفضة مثل 0.1٪ من طبقة أحادية. ويمكن ملاحظة التفاعلات السطحية مثل تبادل H/D أو التحلل الحراري في الوقت الحقيقي ويمكن استنتاج حركية التفاعلات. باستخدام فوهة نابضة لتوليد شعاع الكتلة، يمكن دمج DINeC بكفاءة مع قياس الطيف الكتلي الفخ الأيوني. تسمح الطبيعة الناعمة والخالية من المصفوفة لعملية DINeC بالاقتران مع قدرات MSⁿ في الفخ الأيوني بإجراء تحليل مفصل للغاية لا لبس فيه للتركيبة الكيميائية للعينات العضوية المعقدة والامتزات العضوية على الأسطح.

Introduction

غالبًا ما تستند تقنيات التحليل الحساسة على السطح إلى مسابير الجسيمات مثل الإلكترونات منخفضة الطاقة أو الذرات أو الأيونات التي تتفاعل بقوة مع العينات الصلبة. ونتيجة لذلك ، فإنها تظهر حساسية سطح عالية ويمكن الحصول على معلومات مفصلة عن بنية السطح^1. غير أن المعلومات الكيميائية غالبا ما تكون محدودة. على سبيل المثال ، يمكن أن يعطي التحليل الطيفي للضوء بالأشعة السينية معلومات كمية عن التركيب الذري وعن متوسط البيئة الكيميائية لنوع معين (على سبيل المثال ، ذرات الكربون في جزيء عضوي ممتز على سطح^2). ومع ذلك، من الصعب الحصول على معلومات أكثر تفصيلاً عن الجزيئات المعقدة الممتزة على السطح، مثل هيكلها التفصيلي أو مواقع الربط، باستخدام تقنيات التحليل السطحي القياسية. ومن ناحية أخرى، تتزايد الحاجة إلى هذه المعلومات مع تزايد الاهتمام بالتشغيل السطحي عن طريق الجزيئات العضوية. المجالات الآخذة في التوسع من التوليف على السطح³ أو وظائف السطح عن طريق التعلق من الجزيئات الحيوية⁴^،⁵ هي مثالين بارزين. في جميع هذه المجالات ، يتم التحقيق في الأسئلة الأساسية حول الركيزة – امتزاتي وتفاعلات امتزات – من أجل فهم أفضل للأنظمة. بالنسبة لهذه التحقيقات ، من المستحسن الحصول على أقصى قدر من المعلومات عن الجزيئات الممتزة.

في جزء منه، يمكن أن يعطي قياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي (SIMS) مثل هذه المعلومات. أولاً، SIMS حساس ة للغاية. ثانياً، عندما يتم الكشف عن الامتصاصات المبعثرة وشظاياها عن طريق التصلب المتعدد، يتم الحصول على معلومات تتجاوز التكوين الذري. اعتمادا على طبيعة الأنواع الكيميائية الممتزة على السطح، يمكن تحديدها من خلال كتلتها الجزيئية ونمط جزء لوحظ في الطيف الشامل⁶. الشظايا الناجمة عن الأيونات الأولية يمكن أن تساعد في الواقع لتحديد المواد التي تم تحليلها. ومن ناحية أخرى، إذا كان التعديل الناجم عن الأيون الأولي (التجزئة، والتفاعلات الناجمة عن الأيون، والخلط) للعينة قوياً جداً، فإن معظم المعلومات عن الحالة الأصلية للعينة تضيع. وهكذا، تم بذل جهود كبيرة للحد من التجزؤ في SIMS (على سبيل المثال، استخدام المجموعات الجزيئية المشحونة كالأيون^{الأولية 7}^،⁸^،^9). ومع ذلك ، لا يزال التجزؤ يهيمن على أطياف SIMS من الجزيئات الكبيرة والعينات البيولوجية¹⁰، مما يحد من تطبيق SIMS في مختلف المجالات.

كبديل ، أظهرنا الامتزاز / التأيين الناجم عن المجموعات المحايدة (DINeC) لتكون طريقة تأيين ناعمة وخالية من المصفوفة والتي تم استخدامها بنجاح لتحليل الطيف الكتلي للجزيئات المعقدة¹¹^،¹²^،¹³^،¹⁴^،¹⁵^،¹⁶^،^17. ويستند DINeC على شعاع من المجموعات الجزيئية التي تتكون من 10³ إلى 10⁴ 4 جزيئات SO₂ (الشكل 1). عندما تؤثر التجمعات على العينة ، فإنها تتفاعل بطرق مختلفة مع الجزيئات على السطح وفي السطح: أولاً ، يتم إعادة توزيع جزء من الطاقة الحركية للمجموعة وينشط الامتزاز. وبالمثل ، يتم حل جزيء desorbing في الكتلة أثناء تأثير سطح الكتلة¹¹^،¹⁸^،¹⁹ (الشكل 1 والشكل 2). وبعبارة أخرى ، استنادا إلى لحظة ثنائي القطب عالية من SO₂، والمجموعات تعمل بكفاءة كبيرة كمصفوفة عابرة للanalytes القطبية. ونتيجة لذلك، يحدث الامتزاز لجزيئات الملقات في طاقات عنقودية منخفضة مثل 1 eV/molecule وما دونها. ويدعم كذلك الطبيعة الناعمة لعملية الامتزاز من خلال التبريد السريع للنظام عندما تتحطم مجموعة SO₂ أثناء وبعد تأثير السطح¹¹^،^19. ونتيجة لهذه الجوانب المختلفة، فإن الامتزاز الناجم عن الكتلة من الجزيئات المعقدة مثل الببتيدات والبروتينات والدهون والأصباغ يستمر دون أي تجزئة لجزيئات التنقية¹¹^،¹⁵؛ تظهر أطياف الكتلة النموذجية الذروة المهيمنة عند قيمة m/z للجزيء السليم ([M+H]⁺ أو [M-H]^–، الشكل 3). اعتمادا على عدد وطبيعة المجموعات الوظيفية في جزيء، التقريبات المشحونة متعددة من النموذج [M + n· ح]^{ويلاحظ ن +} ¹¹^،¹⁵^،¹⁸. بالنسبة للجزيئات الحيوية ، يحدث التأيين عادة عن طريق الاستيعاب أو التجريد من البروتون في مجموعة وظيفية أساسية أو حمضية ، على التوالي^11. إذا كانت جزيئات الماء موجودة في العينة ، يمكن لجزيئات SO₂ من الكتلة أن تتفاعل مع جزيئات الماء هذه التي تشكل حمض الكبريتي^18. هذا الأخير يمكن أن يكون بمثابة مصدر بروتون كفاءة مما يعزز عملية التأيين في حالة التأيين عن طريق التراكم البروتون (وضع الأيونات الإيجابية)¹³^،^18.

الشكل 1: التوضيح التخطيطي للاستغال/التأيّن الناجم عن الكتلة والإعداد التجريبي. يتم تنفيذ الامتزاز / التأين الناجم عن الكتلة في وعاء عالي الفراغ. يتم إنتاج شعاع من مجموعات SO₂ (النقاط الصفراء) عن طريق التوسع الأسرع من الصوت من خليط غاز SO₂/ He من فوهة نابضة. أثناء ارتطام سطح الكتلة، يتم الجزيئات السطحية والمتأينة. يتم نقل الأيونات الجزيئية (النقاط الحمراء / البرتقالية) عبر شبكة متحيزة ، ومداخل قمع أيون مزدوجة ، وأدلة أيون octopolar في فخ الأيون لقياس الطيف الكتلي. تظهر الأطياف الجماهيرية النموذجية قمم مهيمنة عند قيم m/z للجزيئات السليمة، هنا: M1 (برتقالي) وM2 (أحمر) في وضع الأيون الإيجابي. تفجير: أثناء ارتطام سطح الكتلة، تذوب الجزيئات المحلّاة في الكتلة المؤثرة أو إحدى شظاياها. مزيد من تحطيم وتبخر جزيئات SO₂ ثم يؤدي إلى العارية، أيون الجزيئية سليمة كما تم الكشف عنها في مطياف الكتلة. انظر أيضا الشكل 2. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: لقطات من محاكاة الديناميات الجزيئية التي توضح الامتزاز الناجم عن الكتلة عن طريق الذوبان. (أ) تقترب مجموعة SO₂ (300 جزيء) من السطح مع 1250 م/س عمودي على السطح الذي يتم امتصاص هبتيد (حمض أسبارتيك-أرجينين، آسيا والمحيط الهادئ-أرجي). (ب) أثناء الارتطام بسطح الكتلة، تتحطم الكتلة. يتفاعل الديبتيد الممتز مع جزيئات SO₂ المحيطة مما يؤدي إلى ذوبانه في واحدة من شظايا الكتلة. (ج) تُصد شظايا الكتلة من السطح. الجزء المسمى (الدائرة الزرقاء) يحمل الديبتيد الذي هو منسي في هذا الجزء. وقد عُدل هذا الرقم من المرجع 19. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الطيف الجماهيري التمثيلي والنموذج الجزيئي للأنجيوتنسين الثاني. (أ) أطياف الكتلة (اللوحة العليا: وضع الأيون الإيجابي، اللوحة السفلية: وضع الأيون السلبي) كما تم الحصول عليها بعد الامتزاز/التأيّني الناجم عن الكتلة من عينة أنجيوتنسين II. تم إعداد العينة عن طريق صب قطرة الحل المعني على رقاقة Si (التي يغطيها أكسيدها الطبيعي). يتم تعيين القمم الرئيسية للجزيء الحيوي السليم ، [M + H]⁺ و [M-H]^–؛ لا يتم ملاحظة أي أنماط تجزئة. الخافتات ([2M + H]⁺، السهم) تشير كذلك إلى الطبيعة الناعمة لعملية الامتزاز. إشارة أيون موجب ة أكثر كثافة بسبب تأثير مجموعات SO₂ ¹⁸. (ب) نموذج ملء الفضاء وتسلسل الأحماض الأمينية من الأنجيوتنسين الثاني. الكرات البيضاء تشير إلى ذرات الهيدروجين. أسود: الكربون؛ الأزرق: النيتروجين؛ الأحمر: الأكسجين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن تطبيق DINeC على أي نوع من العينة الصلبة التي تتوافق مع ظروف عالية الفراغ. لا يلزم إعداد عينة خاصة ، ولا سيما أي مصفوفة يجب تطبيقها قبل قياسات DINeC-MS ، على النقيض من مطامع الطباعة /التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) الطيف الكتلي والتقنيات ذات الصلة²⁰^،²¹. وهذا يتيح قياسات في الوقت الحقيقي للتغيرات الكيميائية للعينة مع ظروف تجريبية مختلفة مثل الضغط الخلفي للأنواع التفاعلية في غرفة الفراغ²² أو درجة حرارة العينة. وقد ثبت أن حد الكشف عن DINeC-MS في نطاق femtomole¹¹. عند تطبيقها على تحليل الجزيئات الحيوية الممتزة على الأسطح الصلبة في نظام الطبقة الفرعية ، تم الكشف عن تغطية سطحية منخفضة بنسبة 0.1٪ من الطبقة الأحادية^23. في نظام التغطية هذا ، تعتمد كثافة الإشارة خطيًا على التغطية السطحية ويمكن استخدام DINeC-MS للتحليل الكمي لتكوين السطح^23. في حالة العينات المختلطة ، من الممكن إجراء تقييم كمي لتكوين العينة¹⁷^،²⁴، حيث لا يلاحظ أي تأثير رئيسي للبيئة الكيميائية على احتمال التأين (على سبيل المثال ، في حالة عينات الدهون / الببتيدات المختلطة^17). هذا هو في تناقض واضح لSIMS، والتي عادة ما يتأثر بشدة احتمال تأين نوع معين من وجود مكونات كيميائية مختلفة (ما يسمى “تأثير مصفوفة”²⁵^،²⁶).

بالإضافة إلى تحليل السطح ، يمكن فحص التركيب الكيميائي في المنطقة تحت السطحية عن طريق التنميط العميق^17. مع الإعداد الحالي ، فإن معدلات الامتزاز النموذجية للامتصاص الناجم عن الكتلة من الجزيئات الحيوية هي من أجل^10-3 نانومتر / ث. وقد لوحظ دقة عمق عالية في نطاق من 1 إلى 2 نانومتر لعينات الدهون / الببتيد مختلطة¹⁷.

حقل آخر من التطبيق هو الجمع بين DINeC-MS مع طبقة رقيقة اللوني (TLC). يمكن تحليل لوحات TLC التقليدية مباشرة عن طريق DINeC-MS. يمكن الحصول على أطياف الكتلة التي تعتمد على الموضع من لوحات TLC وبالتالي يمكن الحصول على الكروماتوجرامات الكتلية المحددة من لوحات TLC²⁷. لا حاجة لإعادة التثّر في التّنافعات المفصولة، وتختلف عن TLC مع ESI²⁸^،²⁹. ليست هناك حاجة إلى مصفوفة لمزيج DINeC-MS + TLC إما ، على النقيض من اقتران TLC مع MALDI²⁸^،²⁹.

اينيونة رذاذ الكهرباء المُمتزاز (DESI) هو أيضًا طريقة إمتزاز/تأين ناعمة لتطبيقات MS³⁰^،^31. الاختلافات الأكثر لفتا بين DINeC وDESI هي: الطبيعة الكمية لDINeC²³، وتوافقها مع ظروف فائقة الفراغ (UHV) ، ولا سيما إمكانية التحقيق في العينات المعدة ونقلها في ظروف UHV دون كسر الفراغ²³، فضلا عن إمكانية إزالة الجزيئات غير القطبية بكفاءة¹⁹.

من حيث المبدأ ، يمكن أن يقترن DINeC كمصدر الامتزاز / التأيين إلى أي نوع من مطياف الكتلة. ومع ذلك ، فإن الجمع مع قياس الطيف الكتلي الفخ الأيوني يتميز بميزتين رئيسيتين: أولاً ، يتوافق عرض النبض ومعدل التكرار لشعاع الكتلة النبضي النموذجي بشكل جيد جدًا مع وقت التراكم المتقطع وكذلك المعدل الطيفي لفخ الأيون¹⁵^،³². ثانياً، تؤدي الطبيعة الناعمة لعملية DINeC إلى امتصاص الجزيئات السليمة. في تركيبة مع^قدرات N MS من قياس الطيف كتلة الفخ أيون، وهذا يسمح لتحليل أشمل من العينات التحقيق¹⁵.

Protocol

ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً في أي وقت. 1. إعداد ركائز للعينات القياسية، وقطع ركائز من رقائق السيليكون (سمك حوالي 0.5 إلى 1 ملم) في قطعة من 1 × 1 سم2. تنظيف ركائز Si في حمام الموجات فوق الصوتية من الإيثانول والأسيتون لمدة 15 دقيقة لكل منهما. تجفيف الركائز في تيار من غاز النيتروجين الجاف. 2- إعداد العينات إعداد عينة قياسية للعينات القياسية، قم بإعداد المحلول الذي يحتوي على جزيئات التحالي وفقًا للسؤال العلمي الذي سيتم تناوله. يجب أن يكون تركيز المناضدة على الأقل 1 × 10-10 مول / لتر. قطرة يلقي 5 إلى 30 ميكرولتر من محلول العينة على الركيزة. اعتمادا على ضغط بخار المذيبات، والسماح للعينة الجافة في ظل الظروف المحيطة أو في المجفف حتى تم تبخر جميع المذيبات وشكلت فيلم جاف. اعتمادا على كمية المادة المطبقة، يمكن أن يكون سمك الفيلم بين عدة عشرة ميكرومتر (الفحص البصري ممكن) وطبقة أحادية إلى نظام أحادي الطبقة الفرعية (وبالتالي لا يمكن الكشف عنها عن طريق العين). قم بتركيب العينات على حامل العينة (على سبيل المثال ، باستخدام الشريط اللاصق أو المشابك التي تم تشديدها بواسطة البراغي ، اعتمادًا على العينات وظروف الفراغ المطلوبة). إذا كان ذلك ممكنا، بالإضافة إلى ذلك جبل عينة مرجعية مثل فيلم ميكرومتر سميكة من أنجيوتنسين الثاني، على حامل العينة. إعداد عينة بديلة استخدام مخططات إعداد عينة بديلة مثل ترسب شعاع الأيون بالرش الكهربائي (ES-IBD) في فراغ أو طلاء تراجع في حل كل منها إذا كان ذلك ممكنًا. عينات جبل التي يتم إعدادها ونقلها في فراغ على حامل عينة DINeC قبل خطوات التحضير. تأكد من أن العينات المغلفة بالغمس جافة بعد خطوة الإعداد النهائية. النظر في أبسط مخطط الإعداد. على سبيل المثال ، للتحقيق في الحبر قلم التمييز ، مجرد رسم نقطة على سطح الركيزة. 3. نقل العينات إلى مطياف كتلة DINeC نقل العينات من الظروف المحيطة إلى غرفة DINeC التي تم إخلاؤها تنفيس نظام قفل التحميل. افتح قفل التحميل وقم بحامل العينة. أغلق قفل التحميل وضخ أسفل غرفة قفل التحميل إلى ضغط أقل من 2 × 10-5 مبار. فتح صمام إلى غرفة DINeC ونقل صاحب العينة مع قضيب نقل إلى المتلاعب الرئيسي. إرفاق حامل العينة إلى المتلاعب. اسحب قضيب النقل وأغلق الصمام بين قفل التحميل وغرفة DINeC. نقل العينات من الفراغ إلى غرفة DINeC التي تم إخلاؤها استخدام حاوية فراغ النقل، والتي يمكن أن تعلق على شفة CF40 من غرفة DINeC. نقل العينات، والتي تم إعدادها في فراغ، مع هذه الحاوية دون كسر الفراغ. تأكد من تركيب العينات على حامل عينة متوافق مع المتلاعب المستخدم في نظام DINeC. إرفاق حاوية فراغ النقل إلى شفة CF40 وضخ أسفل حجم بين الحاوية وغرفة DINeC. مرة واحدة وقد انخفض الضغط أقل من 2 × 10-5 مبار، وفتح صمامات البوابة إلى غرفة DINeC وحاوية فراغ النقل ونقل العينة إلى غرفة DINeC على المتلاعبين باستخدام عصا تمايل أو نظام نقل آخر مع أكثر من 50 سم الحركة الخطية. اسحب نظام النقل وأغلق صمامي البوابة. 4. إعداد خليط الغاز إعداد خليط من حوالي 3٪ SO2 في الهيليوم عن طريق إخلاء اسطوانات الغاز من نظام خلط الغاز لمدة 10 دقيقة. ملء الاسطوانات مع SO2 حتى يتم التوصل إلى ضغط من 1 شريط. كذلك ملء الاسطوانات مع الهيليوم حتى يتم التوصل إلى الضغط الكلي من 30 بار.تنبيه: عند استخدام SO2، فإن احتياطات السلامة ذات الصلة مثل تخزين اسطوانات SO2 في خزانات الغاز المعينة يجب الوفاء بها دائمًا. 5. إعداد مطياف كتلة DINeC افتح الصمام بين أسطوانة الغاز والفوهة. ضبط ضغط خليط الغاز SO2/ He في الخطوط العريضة لنظام خلط الغاز إلى 15 بار. تعيين موضع المتلاعب إلى موضع العينة المرجعية. لقياس أطياف الكتلة الموجبة، قم بتعيين العينة والتحيز في الشبكة إلى +40 و +7 V، على التوالي. لدفع فوهة نبض ينبض ومطياف كتلة فخ أيون، تعيين مولد وظيفة خارجية إلى 2 هرتز. مع مولد تأخير، تعيين تأخير الوقتN بين إشارة فخ واضح من فخ أيون وإشارة الزناد لفوهة نبضية إلى 5 مللي ثانية. في برنامج التحكم ، قم بضبط المعلمات التالية عن طريق الضغط على الأزرار المعنية أو كتابة القيم المعنية في صفحة الوضع في نافذة الحوار الرئيسية: وضع المسح الضوئي: دقة محسنة ، نطاق: m / z 50 – 3000 ، Accu-time: 0.1 مللي ثانية ، متوسط: 10 دورات ، قطبية: إيجابية لقياس أطياف الكتلة الموجبةملاحظة: لقياس الأطياف الأنيونية، يجب أن تكون العينة والتحيز الشبكة سلبية فيما يتعلق بالأرض، يجب أن تتحول القطبية إلى السلبية في برنامج التحكم. 6. قياس أطياف الكتلة بمجرد الوصول إلى ضغط أقل من 3 × 10-6 مبار في غرفة DINeC ، يمكن بدء القياس. بدء القياس عن طريق الضغط أولا من قبل الوقوف ثم الضغط على التشغيل في برنامج التحكم. ابدأ في تسجيل القياسات التي تضغط على زر التشغيل. قياس طيف اختبار من عينة مرجعية مثل أنجيوتنسين الثاني لحوالي 300 s. اتبع الاعتماد الزمني للإشارة باستخدام اللون اللوني تعيين إلى قيمة م /ز المعنية. تحسين كثافة الإشارة عن طريق ضبط تأخير الوقت بين إشارة فخ واضح والإشارة التي تؤدي إلى فوهة نبضية. نقل المتلاعب إلى موضع العينة ليتم قياسها. تحسين كثافة الإشارة عن طريق تعديل موضع العينة داخل مستوى حامل العينة. اكتساب أطياف الكتلة على مدى الفترة الزمنية من الفائدة. تعديل المعلمات التجريبية مثل درجة حرارة العينة أو ضغط الخلفية في الغرفة وفقًا لتفاصيل التجربة. الاستمرار في اتخاذ أطياف الشامل عند تغيير المعلمات التجريبية. 7 – تقييم البيانات بعد الانتهاء من القياس، قم بتحميل مجموعة البيانات المعنية في برنامج تحليل البيانات. حدد الفترة الزمنية للفائدة في اللون مع الزر الأيمن من الماوس. سيتم عرض الطيف المتوسط في نافذة منفصلة. تصدير الطيف كملف بيانات لمزيد من المعالجة في برنامج الاختيار.

Representative Results

في التالي، يتم تقديم مثالين لتطبيق في الوقت الحقيقي من DINeC-MS. ويبين الشكل 4 تغير الطيف الكتلي الذي تم الحصول عليه من الأنجيوتنسين الثاني عندما يتم تسخين العينة إلى حوالي 140 درجة مئوية. عندما يتم الوصول إلى درجة الحرارة النهائية(الشكل 4B، الشكل 4E)، يتميز الطيف بذروة إضافية تشير إلى فقدان كيان H2O(m/z = 1029). عند الحفاظ على العينة في درجة الحرارة تلك ، لوحظ مزيد من التحلل لجزيئات الأنجيوتنسين II(الشكل 4C)، بما في ذلك فقدان إحدى وحدات الأحماض الأمينية الطرفية ، حمض الأبارتيك (ذروة في m /z = 932 ، الشكل 4D). يسمح التحليل الكمي للبيانات بتقييم حركية التفاعل الأساسية(الشكل 4E). وعلى وجه الخصوص، يوضح الشكل 4هاء أن الكيان الذي يحتوي على m/z = 1029 هو كيان وسيط يتحلل أكثر إلى شظايا أصغر كلما زادت الكثافة أولاً ثم انخفضت. وبالتالي فإن ثوابت المعدل المصاحبة هي في نفس ترتيب الحجم. وكمثال ثان، فإن استقصاء تبادل الهيدروجين/الديوتريوم في الأنجيوتنسين الثاني22 هو موضح في الشكل 5. عند التعرض لعينة الأنجيوتنسين إلى D2O في غرفة DINeC (pD2O =10-4 مبار)، يتم توسيع النمط النظائري للأنجيوتنسين الثاني وتحول نحو قيم م/ز أعلى تشير إلى تبادل H بواسطة ذرات D. والعملية سريعة خلال الستين سنة الأولى ولكنها تتباطأ بشكل كبير في سياق التجربة الأخرى: فنمط النظائر في الشكل 5باء يغطي نطاقاً واسعاً من الـ م/ز (حوالي 15 متراً/ز). عندما نحدد درجة الاستخلاص d على أنها عدد ذرات H المتبادلة في جزيء، يمكن استخراج قيم d بين d = 0 إلى d = 13 من الطيف. في الشكل 5C، يتم تقليل نمط النظائر مرة أخرى في العرض. ويمكن أن تعزى هذه الملاحظة إلى الانخفاض الشديد في كثافة القمم المرتبطة بأقل درجات الاستخلاص. في الشكل 5D، يظهر الطيف لأوقات رد الفعل الأطول. ولا يزال نطاق m/z المغطى هو نفسه تقريباً، ولكن مركز كتلة الطيف لا يزال يتحول ببطء نحو زيادة قيم m/z. بالنسبة لأوقات التعرض الطويلة، يصل جزء من الجزيئات إلى أعلى درجة من الاستخلاص، دكحد أقصى = 17. وهو يتوافق مع الحد الأقصى لعدد ذرات H القابلة للاستبدال، والتي يُعطى من خلال عدد ذرات H المرتبطة بمجموعات وظيفية مثل أحماض الكربوكسيليك أو مجموعات الأمين. بالفعل من التطور الزمني للأطياف ، يمكن استنتاج أن تبادل H / D يحدث مع ثوابت معدل مختلفة. للحصول على وصف كمي لهذه الملاحظة، يتم رسم متوسط درجة الاستخلاص في الشكل 5E كدالة للوقت. يكشف فحص النتائج التجريبية (الرموز) عن ثلاثة أنظمة مختلفة: زيادة سريعة في معدل التشغيل d-operative for t < 50 s، ونظام وسيط لـ 50 s < t < 200 s، وزيادة بطيئة ولكنها مستمرة تقريباً لـ t > 200 s. وحاكت النتائج التجريبية عن طريق محاكاة مونت كارلو؛ pseudo-first-من الدرجة الحركية رد فعل مع الثوابت رد الفعل ككان يفترضلتبادل H / D في المجموعات الوظيفية للجزيئات التحقيق22. ولم يتم التوصل إلى اتفاق جيد بين المحاكاة والنتائج التجريبية في جميع النظم الثلاثة إلا عندما تم تطبيق ثلاثة ثوابت مختلفة على الأقل من حيث المعدل كط لتبادل H/D في جزيئات الأنجيوتنسين الثانية. في الشكل 5F,G, يتم عرض الحركية كما هو مستنتج من تركيب أنماط النظائر التجريبية من قبل مجموع أنماط النظائر لدرجات مختلفة من التخلص من(الشكل 5A إلى الشكل 5D). ويلاحظ بوضوح الاتفاق الجيد بين البيانات التجريبية والمحاكاة وكذلك أسعار الصرف المختلفة جدا لدرجات الإزالة المنخفضة والعالية. وبالمقارنة مع القلة المختلفة مثل سداسي الهيكساغليسين، تعزى أسعار الصرف السريعة إلى المجموعات الوظيفية الصريحة، في حين ارتبطت أسعار الصرف البطيئة بمجموعات أميد العمود الفقري للببتيد22. في حين تم قياس هذين المثالين الأولين بعينات أنجيوتنسين II ذات الكثافة الدقيقة ، يوضح الشكل 6 النتائج كما تم الحصول عليها من تغطية تحت مونوية من الأنجيوتنسين II على عينات الذهب كما تم إعدادها عن طريق ترسب شعاع الأيون الكهربائي (ES-IBD)23. ويلاحظ الاعتماد الخطي لشدة الإشارة على كمية المادة على مدى 3 أوامر من الحجم، وأدنى كمية من المادة المكتشفة يتوافق مع 0.1٪ من طبقة أحادية من جزيئات أنجيوتنسين الثاني على سطح الذهب. كما أجريت تجارب تبادل H/D كما هو موضح في الشكل 5 مع الأنجيوتنسين الثاني على الذهب في نظام الطبقة الفرعية23. الشكل 4: المراقبة الآنية للتحلل الحراري للأنجيوتنسين الثاني. (A-C) أطياف الكتلة كما تم الحصول عليها بعد الامتزاز/التأيّن الناجم عن الكتلة من عينة أنجيوتنسين II. (أ) عينة جديدة في RT. (B) عينة ساخنة إلى حوالي 140 درجة مئوية. بالإضافة إلى الذروة عند m/z = 1047، والتي ترتبط بالجزيء السليم [M+H]+، تظهر القمم عند m/z = 932 و1012 و1029 (المشار إليها بالأسهم). (ج) تزداد القمم الأخيرة وتنخفض الذروة الرئيسية مع مرور الوقت عند إبقاء العينة في درجة حرارة مرتفعة. (د) الصيغة الهيكلية للأنجيوتنسين الثاني تشير إلى الجزء (الأقواس البنية) مما يؤدي إلى ظهور الذروة عند m/z = 932 بسبب فقدان وحدة حمض أميني واحدة (حمض الأبارتيك). (هـ) الاعتماد على الوقت لدرجة حرارة العينة وشدة القمم الرئيسية المشار إليها في المؤامرات (A) إلى (جيم). الخطوط الصلبة هي أدلة للعين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: المراقبة في الوقت الحقيقي لتبادل H/D في الأنجيوتنسين الثاني. (A-D) أطياف كتلة الموجبة من أنجيوتنسين الثاني كما تم الحصول عليها عن طريق DINeC-MS. بسبب تبادل H /D ، يتسع نمط النظائر ويتحول نحو قيم m / z أعلى في (B) إلى (D) بالمقارنة مع نمط النظائر للأنواع غير المندرجة الموضحة في (A). الخطوط الحمراء هي البيانات ، خطوط سماوي متقطعة تناسبها مع البيانات مع الأخذ في الاعتبار درجات مختلفة من الاستخلاص. (هـ) متوسط درجة الاستخلاص كدالة للوقت على النحو المستخلص من التجارب (النقاط المفتوحة). وبالإضافة إلى ذلك، يظهر د كدالة للوقت الذي تم استنتاجه عن طريق محاكاة مونتي كارلو. منحنى متقطع أسود: المحاكاة مع الأخذ في الاعتبار ثابت معدل واحد(ك1)؛ منحنى أحمر: مع الأخذ في الاعتبار ثلاثة ثوابت معدل(ك1، ك2، ك3). (F, G) كثافة الإشارة النسبية لدرجات مختارة من الديوتاتوية من الأنجيوتنسين الثاني (رموز + خطوط صلبة) كدالة للوقت جنبا إلى جنب مع النتائج المقابلة لمحاكاة مونتي كارلو (خطوط متقطعة). وقد عُدل هذا الرقم من المرجع 22. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: تطبيق DINeC-MS على أنجيوتنسين الثاني على الذهب في نظام الطبقة الفرعية. (أ) التمثيل التخطيطي لمزيج من ES-IBD للترسب وDINeC-MS لقياس الطيف الكتلي لجزيئات الأنجيوتنسين II المعزولة في نظام الطبقة الفرعية. (ب) الاعتماد على شدة الإشارة على كمية المواد المودعة على العينة كما تم الحصول عليها من مجموعتين مستقلتين من البيانات (رموز مملوءة ومفتوحة). الانسات: الأطياف الكتلة DINeC كما تم الحصول عليها من العينات التي تم إيداع كمية من المادة على النحو المشار إليه. وقد عُدل هذا الرقم من المرجع 23. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في العديد من الدراسات التي أجريت حتى الآن، تم إثبات حساسية عالية من DINeC-MS على مواد مختلفة. في الواقع ، وهذا يسمح قياسات analytes وصولا الى كمية من المادة في نظام femtomole^11. بسبب هذه الحساسية العالية ، يجب إجراء إعداد العينة ، ولا سيما تنظيف الركيزة ، باستخدام مواد كيميائية نقية للغاية من أجل تجنب التلوث في أطياف كتلة DINeC. كما هو الحال بالنسبة للعديد من تقنيات التحليل ، فإن قياس الخلفية المناسبة من الركيزة الفارغة يساعد على فصل القمم عن التحليلات والقمم التي لها أصلها في إعداد الركيزة / العينة.

على الرغم من أننا أظهرنا أن احتمال تأين جزيء analyte معين لا يتأثر بشدة بوجود الإعلانات المشتركة أو المكونات المشتركة في العينات المختلطة¹⁷^،²⁴، قد يختلف احتمال التأين من مادة إلى مادة^13. وبالتالي، فمن المهم أكثر للعمل في ظل ظروف نظيفة لأن الملوثات، اعتمادا على احتمال تأينها، قد تسهم في الإشارة أقوى بكثير من المناجيل. الأيونات المُصلحة (على سبيل المثال، كما هو الحال في العديد من جزيئات الصبغة)، أو الجزيئات ذات المجموعات الوظيفية التي تظهر ميلًا واضحًا نحو استيعاب البروتون أو إزالة البروتونات (أي القواعد أو الأحماض)، تظهر عادة احتمال تأيين كبير في DINeC-MS. إذا لم تكن هذه المجموعة الوظيفية موجودة في الanalyte، يمكن أن يكون احتمال التأين منخفضة. ويمكن بعد ذلك معالجة العينات بواسطة عوامل مؤينة مثل حمض التريفلورو (على سبيل المثال، عن طريق تعرض العينة لضغط بخار العامل المؤين).

وتبين النتائج التمثيلية التي نوقشت في الشكل 4 والشكل 5 انطباق DINeC-MS على التحقيقات الآنية في التفاعلات الكيميائية عن طريق قياس الطيف الكتلي. يوضح الشكل 6 حساسية الطبقة الفرعية للطريقة. إذا تم الجمع بين الخصائص اثنين، يمكن متابعة التفاعلات الكيميائية على الأسطح ومنتجاتها في الوقت الحقيقي^23. هذا يمكن أن يكون على وجه الخصوص من الفائدة لما يسمى “التوليف على السطح” الذي يؤدي إلى تجميع الهياكل الجزيئية الكبرى على الأسطح³^،³³^،³⁴^،³⁵^،^36. وفي الإعداد الحالي، يمكن رصد هذه التفاعلات السطحية على الأسطح ذات التفاعل المنخفض مثل الذهب²³ والمعادن النبيلة الأخرى؛ التجارب هي أكثر صعوبة أن يتم تنفيذها على الأسطح رد الفعل للغاية مثل أسطح السيليكون³⁷، كما ضغط القاعدة في غرفة الامتزاز في^10-7– mbar-range. وتعالج الأنشطة الحالية هذا القيد ويجري بناء جهاز DINeC متوافق مع UHV. في حالة الأسطح التفاعلية ، يجب اختبار التفاعل بين SO₂ وسطح الركيزة قبل قياسات الامتصاصات السطحية وردود الفعل السطحية.

وبما أن شعاع الكتلة محايد، فإنه لا يمكن تركيزه. وهكذا يعطى حجم الشعاع على العينة من خلال هندسة إعداد وفتحة من المقشود في الاستخدام؛ القيم النموذجية لقطر شعاع على العينة هو واحد إلى عدة ملليمترات. ونتيجة لذلك، التصوير عن طريق مسح العينة ممكن فقط مع دقة منخفضة جدا. من ناحية أخرى ، نظرا لاحتمال التأيين عالية¹³، DINeC بكفاءة يجعل من استخدام الجزيئات desorbed. وهكذا ، مزيج من DINeC – MS وكاشف التصوير الأيوني³⁸ ويبدو أن جذابة للغاية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بالدعم المالي من مركز هيلمهولتز الدولي للبحوث العادلة (HICforFAIR) وكلية هيلمهولتز للدراسات العليا لأبحاث هادرون وأيون (P.S.). يشكر المؤلفون البروفيسور روشينباخ (جامعة أكسفورد) وفريقه على التعاون المثمر في التجارب المشتركة ES-IBD/DINeC.

Materials

Acetone rotisolv HPLC	Roth	7328.2	HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC	Roth	p076.1	HPLC Gradient Grade
Helium	Praxair	4800086706	Purity 99.9999%
Nitrogen	Praxair	40728408	Purity 99.5 – 100%
Silicon Wafers	Active Business Company GmbH	G60007
Sulfur dioxide	Air Liquide	P1734S10R0A001	Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS	Roth	HN43.1	Ultra LC-MS

References

Vickerman, J. C., Gilmore, I. . Surface Analysis: The Principal Techniques. , (2009).
Reutzel, M., Münster, N., Lipponer, M. A., Länger, C., Höfer, U., Koert, U., Dürr, M. Chemoselective Reactivity of Bifunctional Cyclooctynes on Si(001). Journal of Physical Chemistry C. 120, 26284-26289 (2016).
Grill, L., Dyer, M., Lafferentz, L., Persson, M., Peters, M., Hecht, S. Nano-architectures by covalent assembly of molecular building blocks. Nature Nanotechnol. 2, 687-691 (2007).
Stutzmann, M., Garrido, J. A., Eickhoff, M., Brandt, M. S. Direct biofunctionalization of semiconductors: A survey. Physica Status Solidi A. 203, 3424-3437 (2006).
Adler-Abramovich, L., Gazit, E. The physical properties of supramolecular peptide assemblies: from building block association to technological applications. Chemical Society Reviews. 43, 6881-6893 (2014).
Vickerman, J. C., Briggs, D. . TOF-SIMS: Materials Analysis by Mass Spectrometry, 2nd ed. , (2013).
Winograd, N. The magic of cluster SIMS. Analytical Chemistry. 77, 142-149 (2005).
Ichiki, K., Ninomiya, S., Nakata, Y., Honda, Y., Seki, T., Aoki, T., Matsuo, J. High Sputtering Yields of Organic Compounds by Large Gas Cluster Ions. Applied Surface Science. 255, 1148-1150 (2008).
Mochiji, K., Hashinokuchi, M., Moritani, K., Toyoda, N. Matrix-free Detection of Intact Ions from Proteins in Argon-Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23, 648-652 (2009).
Yokoyama, Y., Aoyagi, S., Fujii, M., Matsuo, J., Fletcher, J. S., Lockyer, N. P., Vickerman, J. C., Passarelli, M. K., Havelund, R., Seah, M. P. Peptide Fragmentation and Surface Structural Analysis by Means of ToF-SIMS Using Large Cluster Ion Sources. Analytical Chemistry. 88, 3592-3597 (2016).
Gebhardt, C. R., Tomsic, A., Schröder, H., Durr, M., Kompa, K. L. Matrix-Free Formation of Gas-Phase Biomolecular Ions by Soft Cluster-Induced Desorption. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 4162-4165 (2009).
Baur, M., Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Durr, M. Soft Clusterinduced Desorption and Ionization of Biomolecules – Influence of Surface Load and Morphology on Desorption Efficiency. Applied Physics Letters. 99, 234103 (2011).
Lee, B. J., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Quantification of the Ionization Probability During Desorption/Ionization of Oligopeptides Induced by Neutral Cluster Impact. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 27, 1090-1094 (2013).
Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Schroder, H., Kompa, K. L., Durr, M. Observation of Ionic Desorption Channels in Cluster-induced Desorption of Alkali Halides – Influence of Surface Electronic Properties and Surface Configuration. Chemical Physics Letters. 556, 77-81 (2013).
Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact as a Soft and Efficient Ionization Source for Ion Trap Mass Spectrometry of Biomolecules. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28, 290-296 (2014).
Kley, C. S., Dette, C., Rinke, G., Patrick, C. E., Cechal, J., Jung, S. J., Baur, M., Durr, M., Rauschenbach, S., Giustino, F., Stepanow, S., Kern, K. Atomic-Scale Observation of Multiconformational Binding and Energy Level Alignment of Ruthenium-Based Photosensitizers on TiO2 Anatase. Nano Letters. 14, 563-569 (2014).
Portz, A., Aoyagi, S., Durr, M. Soft depth-profiling of mixed peptide/lipid samples by means of cluster induced desorption/ionization mass spectrometry – high depth resolution and low matrix effect. Biointerphases. 13, 03B405 (2018).
Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Frank, A. J., Neuderth, P., Eickhoff, M., Durr, M. Influence of the Cluster Constituents’ Reactivity on the Desorption/Ionization Process Induced by Neutral SO2 Clusters. Journal of Chemical Physics. 146, 134705 (2017).
Schneider, P., Durr, M. Cluster-induced desorption investigated by means of molecular dynamics simulations – Microsolvation in clusters of polar and non-polar constituents. Journal of Chemical Physics. 150, 214301 (2019).
Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10 000 Daltons. Analytical Chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90, 240-265 (2018).
Portz, A., Gebhardt, C. R., Durr, M. Real-Time Investigation of the H/D Exchange Kinetics of Porphyrins and Oligopeptides by Means of Neutral Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Journal of Physical Chemistry B. 121, 11031-11036 (2017).
Portz, A., Baur, M., Rinke, G., Abb, S., Rauschenbach, S., Kern, K., Dürr, M. Chemical Analysis of Complex Surface-Adsorbed Molecules and Their Reactions by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90, 3328 (2018).
Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Mass Spectrometry of Oligopeptides in the Presence of Large Amounts of Alkali Halides Using Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact. Biointerphases. 11, 02A316 (2016).
Shard, A. G., Spencer, S. J., Smith, S. A., Havelund, R., Gilmore, I. S. . International Journal of Mass Spectrometry. 377, 599-609 (2015).
Nakano, S., Yamagishi, T., Aoyagi, S., Portz, A., Durr, M., Iwai, H., Kawashima, T. Evaluation of Matrix Effects on TOF-SIMS Data of Leu-enkephalin and DOPC Mixed Samples. Biointerphases. 13, 03B403 (2018).
Heep, J., Tuchecker, P. H. K., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. ACS Omega. 4, 22426-22430 (2019).
Morlock, G., Schwack, W. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 29, 1157-1171 (2010).
Cheng, S. C., Huang, M. Z., Shiea, J. Thin layer chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218, 2700-2711 (2011).
Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306, 471 (2004).
Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science. 311, 1566 (2006).
Dürr, M., Gebhardt, C. Ion generation in mass spectrometers by cluster bombardment. US Patent. , (2019).
Lindner, R., Kuhnle, A. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. ChemPhysChem. 16, 1582-1592 (2015).
Dong, L., Liu, P. N., Lin, N. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. Accounts of Chemical Research. 48, 2765-2774 (2015).
Björk, J. Reaction mechanisms for on-surface synthesis of covalent nanostructures. Journal of Physics: Condensed Matter. 28, 083002 (2016).
Rauschenbach, S., Rinke, G., Gutzler, R., Abb, S., Albarghash, A., Le, D., Rahman, T. S., Durr, M., Harnau, L., Kern, K. Two-Dimensional Folding of Polypeptides into Molecular Nanostructures at Surfaces. ACS Nano. 11, 2420-2427 (2017).
Dürr, M., Höfer, U. Dissociative adsorption of molecular hydrogen on silicon surfaces. Surface Science Reports. 61, 465-526 (2006).
Zhang, J., Franzreb, K., Aksyonov, S. A., Williams, P. Mass Spectra and Yields of Intact Charged Biomolecules Ejected by Massive Cluster Impact for Bioimaging in a Time-of-Flight Secondary Ion Microscope. Analytical Chemistry. 87, 10779-10784 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Bomhardt, K., Schneider, P., Portz, A., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60487, doi:10.3791/60487 (2020).

Automatically Generated