Captura de la respuesta de la lesión cardíaca de las poblaciones celulares objetivo a través de imágenes tridimensionales del corazón despejado

El corazón ha sido considerado durante mucho tiempo como un órgano post-mitótico, sin embargo, la evidencia reciente demuestra que la renovación de cardiomiocitos ocurre en el corazón humano adulto en alrededor del 1% por año¹. Sin embargo, estas bajas tasas de rotación de cardiomiocitos son insuficientes para reponer la pérdida masiva de tejido que se produce después de una lesión. Un corazón que ha sufrido un infarto de miocardio perderá alrededor de mil millones de cardiomiocitos, a menudo sirviendo como preludio de la insuficiencia cardíaca y la muerte súbita cardíaca^2,3. Con más de 26 millones de personas afectadas por insuficiencia cardíaca en todo el mundo, existe una necesidad insatisfecha de terapias que puedan revertir los daños infligidos por la enfermedad cardíaca⁴.

Con el fin de cerrar esta brecha en las terapias, los científicos han comenzado a investigar los mecanismos evolutivamente conservados que subyacen a la regeneración endógena después de la lesión. Un modelo para estudiar la regeneración cardíaca de los mamíferos es el ratón neonatal. Dentro de la semana siguiente al nacimiento, los ratones neonatales tienen una respuesta regenerativa robusta después de daños cardíacos⁵. Hemos demostrado previamente que los ratones neonatales pueden regenerar su corazón a través de la proliferación de cardiomiocitos después de una resección apical⁵. Aunque esta técnica puede evocar la regeneración cardíaca en los neonatos, la cirugía carece de relevancia clínica para las lesiones cardíacas humanas. Con el fin de imitar una lesión humana en el modelo de ratón neonatal, hemos desarrollado una técnica para inducir un infarto de miocardio a través de una oclusión de la arteria coronaria^6. Esta técnica requiere ligadura quirúrgica de la arteria descendente anterior izquierda (LAD), que es responsable de entregar 40%–50% de la sangre al miocardio ventricular izquierdo^6,7. Por lo tanto, la cirugía resulta en un infarto que afecta a una porción significativa de la pared ventricular izquierda. Este daño al miocardio estimulará la proliferación de cardiomiocitos y la regeneración del corazón en los neonatos^5.

La cirugía de oclusión de la arteria coronaria proporciona un método altamente reproducible y directamente traslacional para descubrir el funcionamiento interno de la regeneración cardíaca. La cirugía neonatal es paralela a la aterosclerosis de la arteria coronaria en el corazón humano, donde la acumulación de placa dentro de las paredes internas de las arterias puede causar una oclusión y posterior infarto de miocardio^8. Debido a un vacío en los tratamientos terapéuticos para pacientes con insuficiencia cardíaca, una oclusión en el LAD se asocia con tasas de mortalidad que alcanzan hasta el 26% dentro de un año después de la lesión^9,y en consecuencia se ha llamado el “fabricante de viudas”. Los avances en el tratamiento requieren un modelo que refleje con precisión los complejos efectos fisiológicos y patológicos de las lesiones cardíacas. Nuestro protocolo quirúrgico para lesiones cardíacas de ratón neonatal proporciona una plataforma que permite a los investigadores investigar las señales moleculares y celulares que señalan la regeneración cardíaca de los mamíferos después de la lesión.

Investigaciones recientes ponen de relieve la relación dinámica entre el entorno extracelular y la proliferación de los cardiomiocitos. Por ejemplo, la ventana regenerativa postnatal se puede extender disminuyendo la rigidez de la matriz extracelular que rodea el corazón¹⁰. Los biomateriales de la matriz extracelular neonatal también pueden promover la regeneración cardíaca en corazones adultos de mamíferos después de una lesión cardíaca^11. También acompañando la proliferación de cardiomiocitos es una respuesta angiogénica^12,13; la formación de arterias colaterales únicas en el corazón regenerador del ratón neonatal demostró ser esencial para estimular la regeneración cardíaca^12. Además, nuestro laboratorio ha demostrado que la señalización nerviosa regula la proliferación de cardiomiocitos y la regeneración cardíaca a través de la modulación de los niveles de factor de crecimiento, así como la respuesta inflamatoria después de la lesión¹⁴. Estos hallazgos enfatizan la necesidad de rastrear las poblaciones de células no miocitos en respuesta a una lesión cardíaca. Para lograr este objetivo, hemos aprovechado el sistema de recombinación Cre-lox en líneas de ratones transgénicos para incorporar la expresión constitutiva o condicional de proteínas fluorescentes de reportero para el rastreo de linaje. Además, podemos utilizar métodos avanzados para determinar el patrón de expansión clonal con la línea de ratón Rainbow, que se basa en la expresión estocástica de los reporteros fluorescentes multicolores dependientes de Cre para determinar la expansión clonal de las poblaciones de células objetivo^15. El uso del trazado de linaje con la cirugía de oclusión de la arteria coronaria neonatal es una poderosa herramienta para disuacar los intrincados mecanismos celulares de la regeneración cardíaca.

El seguimiento del linaje de células etiquetadas fluorescentes con imágenes tridimensionales (3D) de órganos enteros es difícil de lograr utilizando la técnica tradicional de seccionamiento y reconstrucción, especialmente cuando las poblaciones celulares son frágiles, como las fibras nerviosas o los vasos sanguíneos. Mientras que las imágenes directas de montaje completo del órgano mediante seccionamiento óptico pueden capturar poblaciones celulares superficiales, las estructuras que residen profundamente dentro del tejido permanecen inaccesibles. Para eludir estas barreras, se han desarrollado técnicas de limpieza de tejidos para reducir la opacidad de los tejidos de órganos enteros. Recientemente, se han realizado avances significativos a los métodos basados en hidrogel rígido con imágenes rígidas híbridos con acrilamida transparente, que limpian el tejido fijo mediante la extracción de lípidos^16. También se toman medidas para homogeneizar el índice de refracción y, posteriormente, reducir la dispersión de la luz durante la toma de imágenes^17. Uno de estos métodos es la CLARIDAD activa, que acelera la descomposición de los lípidos mediante el uso de electroforesis para penetrar el detergente en todo el tejido¹⁸. Aunque eficaz, este método de limpieza de tejido requiere equipos costosos y puede causar daño tisular, haciendo que el enfoque sea incompatible con poblaciones celulares frágiles como los nervios cardíacos^19. Por lo tanto, empleamos el enfoque pasivo CLARITY, que se basa en el calor para facilitar suavemente la penetración del detergente, ayudando así en la retención de intrincadas estructuras celulares^20,21.

Por lo general, se piensa que la CLARIDAD Pasiva es menos eficiente que la CLARITY¹⁸activa, ya que la técnica suele ir acompañada de dos obstáculos principales: la incapacidad de eliminar toda la profundidad del órgano y la gran cantidad de tiempo necesario para limpiar los tejidos adultos. Nuestro enfoque pasivo DE CLARITY supera ambas barreras con un proceso de limpieza expeditado que es capaz de eliminar completamente el tejido cardíaco neonatal y adulto. Nuestra técnica pasiva de limpieza de tejido CLARITY ha alcanzado una eficiencia que permite la visualización de una variedad de poblaciones de células cardíacas, incluyendo poblaciones raras distribuidas por todo el corazón adulto. Cuando el corazón despejado se muestra con microscopía confocal, se puede iluminar la arquitectura del patrón específico de la célula durante el desarrollo, la enfermedad y la regeneración.