クリアされた心臓3次元イメージングによる標的細胞集団の心臓損傷応答のキャプチャ

心臓は長い間、マイトアティック後の器官であると考えられてきましたが、最近の証拠は、心筋細胞の再生^が成人の人間の心臓で1年に約1%で起こることを示しています。しかし、これらの低い心筋細胞の回転率は、傷害後に起こる組織の大規模な損失を補充するには不十分である。心筋梗塞に苦しんでいる心臓は約10億個の心筋細胞を失い、しばしば心不全と突然の心臓死の前兆として^22,33を果たします。世界中で2,600万人以上の人々が心不全の影響を受けているので、心臓病⁴によって引き起こされた損害を取り消すことができる治療のための満たされていない必要性があります。

治療におけるこのギャップを埋めるために、科学者たちは、傷害後の内因性再生の根源である進化的に保存されたメカニズムの調査を開始しました。哺乳類の心臓再生を研究するための1つのモデルは、新生児マウスである。生後1週間以内に、新生児マウスは心臓損傷⁵に続く強い再生応答を有する。我々は以前、新生児マウスが心尖^部切除5に続く心筋細胞増殖を介して心臓を再生できることを実証した。この技術は新生児の心臓再生を呼び起こす可能性があるが、手術は人間の心臓傷害との臨床的関連性を欠いている。新生児マウスモデルにおける人的傷害を模倣するために、冠状動脈閉塞6を通して心筋梗塞を誘発する技術を^{開発した。}この技術は、左心室心筋^6,7に血液の40%〜50%を送達する役割を果たす左前下降下動脈(LAD)の外科的結紮^{を必要とする7}。したがって、手術は左心室壁のかなりの部分に影響を与える梗塞をもたらす。心筋へのこの損傷は、新生児における心筋細胞増殖および心臓再生を刺激する^5.

冠状動脈閉塞手術は、心臓再生の内部の働きを明らかにするために、非常に再現性の高い、直接翻訳方法を提供します。新生児手術は、ヒト心臓における冠動脈アテローム性動脈硬化症と平行して、動脈の内壁内にプラークが蓄積すると閉塞とその後の心筋梗塞8を引き起こす可能性^がある。心不全患者の治療治療の空隙のために、LADの閉塞は傷害⁹後1年以内に最大26%に達する死亡率に関連しており、その結果、「未亡人メーカー」と呼ばれています。治療の進歩には、心臓損傷の複雑な生理学的および病理学的影響を正確に反映するモデルが必要です。新生児マウス心臓損傷のための当社の外科プロトコルは、研究者が損傷後に哺乳類の心臓再生を知らせる分子および細胞の手がかりを調査することを可能にするプラットフォームを提供します。

最近の研究では、細胞外環境と増殖型心筋細胞との動的関係が明示されています。例えば、心部¹⁰を取り巻く細胞外マトリックスの剛性を減少させることにより、出生後回生期の窓を延長することができる。新生児細胞外マトリックスからの生体材料はまた、心臓損傷¹¹に続く成人哺乳類の心臓における心臓再生を促進することができる。また、心筋細胞増殖に伴う血管形成応答^12,13;12,新生児マウスの再生心臓に特有の副動脈形成は、心臓再生¹²を刺激するために不可欠であることが示された。さらに、我々の研究室は神経シグナル伝達が成長因子レベルの変調を介して心筋細胞増殖および心臓再生を調節することを実証^した。これらの知見は、心臓損傷に応答して非筋細胞集団を追跡する必要性を強調している。この目的を達成するために、トランスジェニックマウスラインにおけるCre-lox組換えシステムを利用して、系統トレースのための蛍光レポータータンパク質の構成的または条件的な発現を組み込んでいます。さらに、高度な方法を用いて、Cre依存型の多色蛍光レポーターの確率的発現に依存するレインボーマウスラインを用いてクローン拡張パターンを決定し、標的細胞集団¹⁵のクローン拡張を決定することができる。新生児冠動脈閉塞手術で系統トレースを採用することは、心臓再生の複雑な細胞機構を解剖するための強力なツールです。

3次元(3D)の臓器全画像を用いて蛍光標識細胞の系統を追跡することは、特に神経線維や血管などの細胞集団が壊れやすい場合に、従来の断面化と再構成技術を用いて達成することは困難である。光学断面による臓器の直接全実装イメージングは表面的な細胞集団を捕捉することができるが、組織の奥深くに存在する構造はアクセスできないままである。これらの障壁を回避するために、組織クリア技術は、臓器組織全体の不透明度を低減するために開発されています。近年、脂質抽出¹⁶を介して固定組織をクリアする透明脂質交換アクリルアミドハイブリジッドリジッドイメージング適合組織hYdrogel(CLARITY)ベースの方法に大きな進歩がなされている。また、屈折率を均質化し、その後、撮像しながら光散乱を低減するステップも取^られる。そのような方法の1つは活性なCLARITYであり、電気泳動を用いて組織¹⁸全体に洗浄剤を浸透させることによって脂質分解を促進する。効果的であるが、この組織の清算方法は高価な機器を必要とし、組織損傷を引き起こす可能性があり、心臓神経¹⁹のような脆弱な細胞集団との相容れないアプローチを作る。したがって、我々は穏やかに洗剤の浸透を促進するために熱に依存する受動的なCLARITYアプローチを採用し、したがって、複雑な細胞構造^20、21,21の保持を支援する。

受動クラリティは、通常、アクティブなCLARITY¹⁸よりも効率が悪いと考えられていますが、この技術には、臓器の深さ全体をクリアできないことと、成人組織をクリアするために必要な膨大な時間という2つの大きな障害がしばしば伴います。私たちの受動的なCLARITYアプローチは、新生児および成人心臓組織を完全にクリアすることができる迅速な清算プロセスでこれらの障壁の両方を克服する。当社の受動的なCLARITY組織クリアリング技術は、成人心臓全体に分布する稀な集団を含む様々な心臓細胞集団の可視化を可能にする効率に達した。クリアされた心臓を共焦点顕微鏡で画像化すると、発達中、疾患、再生中の細胞特異的パターニングのアーキテクチャを照らすことができます。