Het vastleggen van de cardiale letselrespons van gerichte celpopulaties via Cleared Heart Driedimensionale beeldvorming

Het hart is al lang beschouwd als een post-mitotisch orgaan, maar recent bewijs toont aan dat cardiomyocyte vernieuwing optreedt in het volwassen menselijk hart op ongeveer 1% per jaar¹. Echter, deze lage tarieven van cardiomyocyte omzet zijn onvoldoende om het enorme verlies van weefsel dat optreedt na letsel aan te vullen. Een hart dat heeft geleden een hartinfarct zal verliezen ongeveer een miljard cardiomyocyten, vaak dienen als een prelude op hartfalen en plotselinge hartdood^2,3. Met meer dan 26 miljoen mensen getroffen door hartfalen wereldwijd, is er een onvervulde behoefte aan therapieën die de schade toegebracht door hart-en vaatziekten kan keren⁴.

Om deze kloof in de therapieën te overbruggen, zijn wetenschappers begonnen met het onderzoeken van evolutionair geconserveerde mechanismen die ten grondslag liggen aan endogene regeneratie na letsel. Een model voor het bestuderen van zoogdier hartregeneratie is de neonatale muis. Binnen de week na de geboorte hebben neonatale muizen een robuuste regeneratieve respons na hartschade⁵. We hebben eerder aangetoond dat neonatale muizen hun hart kunnen regenereren via cardiomyocyte proliferatie na een apicale resectie⁵. Hoewel deze techniek hartregeneratie in de neonaten kan oproepen, mist de operatie klinische relevantie voor menselijke hartletsels. Om een menselijk letsel in het neonatale muismodel na te bootsen, hebben we een techniek ontwikkeld om een hartinfarct te veroorzaken door middel van een coronaire slagader occlusie⁶. Deze techniek vereist chirurgische ligatie van de linker voorste dalende slagader (LAD), die verantwoordelijk is voor het leveren van 40%-50% van het bloed aan de linker ventriculaire myocardium^6,7. Zo resulteert de operatie in een infarct dat een aanzienlijk deel van de linker ventriculaire wand beïnvloedt. Deze schade aan het myocardium zal cardiomyocyteproliferatie en hartregeneratie bij neonaten stimuleren⁵.

De coronaire oclusie chirurgie biedt een zeer reproduceerbare en direct translationele methode om de innerlijke werking van hartregeneratie te ontdekken. De neonatale chirurgie parallellen coronaire slagader atherosclerose in het menselijk hart, waar accumulatie van plaque binnen de binnenwanden van de slagaders kan leiden tot een occlusie en de daaropvolgende hartinfarct⁸. Als gevolg van een leegte in therapeutische behandelingen voor patiënten met hartfalen, een occlusie in de LAD wordt geassocieerd met sterftecijfers tot 26% binnen een jaar na letsel⁹, en bijgevolg is genoemd de “weduwe maker.” Vooruitgang in de therapieën vereist een model dat nauwkeurig de complexe fysiologische en pathologische effecten van cardiale letsel weerspiegelt. Ons chirurgisch protocol voor neonatale muis hartletsel biedt een platform waarmee onderzoekers de moleculaire en cellulaire signalen die zoogdier hartregeneratie signaal na letsel te onderzoeken.

Recent onderzoek benadrukt de dynamische relatie tussen de extracellulaire omgeving en het verspreiden van cardiomyocyten. Bijvoorbeeld, de postnatale regeneratieve venster kan worden uitgebreid door het verminderen van de stijfheid van de extracellulaire matrix rond het hart¹⁰. Biomaterialen uit de neonatale extracellulaire matrix kunnen ook hartregeneratie bevorderen bij volwassen zoogdierharten na hartletsel¹¹. Ook de begeleidende cardiomyocyteproliferatie is een angiogene respons^12,13; bijkomende slagadervorming die uniek is voor het regenererende hart van de neonatale muis bleek essentieel te zijn voor het stimuleren van hartregeneratie¹². Bovendien heeft ons lab aangetoond dat zenuwsignalering cardiomyocyteproliferatie en hartregeneratie reproduceert via modulatie van groeifactorniveaus, evenals de ontstekingsreactie na letsel¹⁴. Deze bevindingen benadrukken de noodzaak om niet-myocyte celpopulaties te traceren in reactie op hartletsel. Om dit doel te bereiken, hebben we gebruik gemaakt van de Cre-lox recombination systeem in transgene muizen lijnen te nemen constitutieve of voorwaardelijke expressie van fluorescerende reporter eiwitten voor lineage tracing. Bovendien kunnen we geavanceerde methoden gebruiken om de kloonexpansiepatronen te bepalen met de Rainbow muislijn, die is gebaseerd op de stochastische expressie van de Cre-afhankelijke, multi-color fluorescerende verslaggevers om de kloonexpansie van gerichte celpopulaties te bepalen¹⁵. Gebruik te maken van afstamming traceren met de neonatale kransslagader occlusie chirurgie is een krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de ingewikkelde cellulaire mechanismen van hartregeneratie.

Het bijhouden van de afstamming van fluorescerende gelabelde cellen met driedimensionale (3D) hele orgaanbeeldvorming is moeilijk te bereiken met behulp van traditionele sectioning en reconstructie techniek – vooral wanneer celpopulaties kwetsbaar zijn, zoals zenuwvezels of bloedvaten. Terwijl directe geheel-mount beeldvorming van het orgaan door optische sectioning oppervlakkige celpopulaties kan vangen, structuren die diep in het weefsel verblijven ontoegankelijk blijven. Om deze barrières te omzeilen, zijn weefselclearingtechnieken ontwikkeld om de ondoorzichtigheid van hele orgaanweefsels te verminderen. Onlangs zijn aanzienlijke vooruitgang geboekt op clear lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel (CLARITY)-gebaseerde methoden, die vast weefsel wissen via lipide extractie¹⁶. Er worden ook stappen ondernomen om de brekingsindex te homogeniseren en vervolgens de lichtverstrooiing te verminderen terwijl imaging¹⁷. Een dergelijke methode is actieve helderheid, die lipideafbraak versnelt met behulp van elektroforese om het wasmiddel door het hele weefsel te penetreren¹⁸. Hoewel effectief, deze weefsel clearing methode vereist dure apparatuur en kan weefselschade veroorzaken, waardoor de aanpak onverenigbaar met fragiele celpopulaties zoals de hartzenuwen¹⁹. Zo maken we gebruik van de passieve CLARITY-benadering, die afhankelijk is van warmte om de penetratie van detergentia voorzichtig te vergemakkelijken, waardoor we helpen bij het behoud van ingewikkelde celstructuren^20,21.

Passieve HELDERHEID wordt meestal beschouwd als minder efficiënt dan actieve HELDERHEID^18,omdat de techniek vaak gepaard gaat met twee belangrijke obstakels: het onvermogen om de gehele orgaandiepte te wissen en de uitgebreide hoeveelheid tijd die nodig is om volwassen weefsels te wissen. Onze passieve CLARITY-aanpak overwint beide barrières met een snel clearingproces dat in staat is om neonatale en volwassen hartweefsel volledig te zuiveren. Onze passieve CLARITY tissue clearing techniek heeft een efficiëntie bereikt die de visualisatie van een verscheidenheid van hartcelpopulaties mogelijk maakt, met inbegrip van zeldzame populaties verspreid over het volwassen hart. Wanneer het gewiste hart wordt afgebeeld met confocale microscopie, kan de architectuur van celspecifieke patronen tijdens ontwikkeling, ziekte en regeneratie worden verlicht.