元ヴィヴォ・ランゲンドルフ・パーフュード・ハーツの眼電図と電気生理学研究

すべての実験は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイド(第8版)に従って行われました。これらの研究で使用されるすべての方法とプロトコルは、NIHが発表した実験動物のケアと使用のためのガイドラインに従って、小児病院の制度的動物ケアと使用プロトコル委員会によって承認されています。この研究で使用されるすべての動物は、実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠して人道的なケアを受けました。 1. 準備 6 L の修飾クレブス ヘンセロイト溶液16を調製する (mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4, 24.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 10.0 グルコース, 2.0 ピルビン酸ナトリウム, 2% アルブミン, 2.0 CaCl2)実験の日にCaCl2を添加すると、時間が経つにつれて、リン酸塩の存在下で、塩化カルシウムはリン酸カルシウムとして溶液から末端に沈殿する。 滅菌濾過後にpHを7.4に調整します(細孔サイズ:0.22μm)。溶液の浸透性を調べて、275−310 mOsm/kgの範囲を確認してください。心臓が剥離した直後に使用するために氷の上で冷却する1 L。水浴中の3Lを約37°Cに温め、カルボゲンでバブリングする(95%O2、5%CO2)。注:冷たい液体は溶解する気体の容量が増加しているので、温暖化は気泡と潜在的な塞栓症を最小限に抑えます。したがって、修正されたクレブス・ヘンセレitメディアが灌流システムを通過して暖かくなるにつれて、ガスは気泡として放出されます。 心プレジアの2 Lを調製する(修飾デルニド心プレギア溶液、表1)。500 mLビーカーを満たすために氷のキューブトレイに十分な心麻痺を凍結します。 循環水浴を42°Cに設定します。ポンプの電源を入れ、閉じた水性加熱ループで含まれる浸透剤を循環させます(材料の完全なリストについては、材料表および図1を参照)。注:温水循環水浴は、水上ジャケットチューブと熱交換器を温めるために使用されます。 システムを通して水中の普遍的な洗剤の1%の溶液の2 Lを実行することによってきれいな管回路およびチャンバー。精製水の>4 Lでランゲンドルフシステムのすべてのチューブ回路とチャンバーをすすいでください。すべての水がシステムから取り除かれるまでポンプを実行します。 灌流ポンプ(ポリプロピレンフィルター、細孔サイズ>5μm)に沿って合成膜フィルターを追加します。80 kPaで95%O2と5%CO2のマイクロファイバー酸素供給器(ヘモフィルター)をガス化します。注:アルブミンを使用する場合、多くの場合、チューブ回路を介して酸素化および/またはポンプ活性に関連する凍結が起こり、凍結する。泡立て防止化合物(消泡Y30エマルジョン)を定期的に(〜30分毎)にドロップワイズ添加し、発生時にクエンチすることができます。 大小オラの上またはバブルトラップにある圧力センサーの2点キャリブレーション(0および60 mmHg)を確認します。必要に応じてキャリブレーションを行います。 心臓切除の直前に、ランゲンドルフループ灌流システムにメディアを注ぎます。排煙剤が酸素化された吸腐剤でガス化されたマイクロファイバー酸素供給器(ヘモフィルター)を通過し、熱交換器を通って大成で37°Cの媒体を吸い込む温度を維持します。 循環水浴を42°Cなど37°Cより数度高く設定し、交換時およびシステム全体の熱損失を考慮します。循環する浸透熱温度を熱電対で監視します。 2. 心臓切除とランゲンドルフ灌流 ケタミン(20mg/kg)とキシラジン(2mg/kg)の筋肉内注射で豚を鎮静し、気管内チューブで挿管する。誘導のために、フェンタニル(50μg/kg)およびロクロニウム(1mg/kg)の静脈内(I.V.)ボーラス注射を投与する。吸入イソフルラン(0.5−3%)、フェンタニル(10−25μg/kg)、およびパンクロニウム(1 mg/kg)で麻酔を維持します。注:この原理実証研究では、2.5−10.5kg体重と18−137gの体重から及ぶ若年ヨークシャー豚(14-42日齢、n =18)を使用した(図2)。誘導のための追加の注射が必要な場合は、ケタミン(10 mg/kg)を注入することができます。 動物が完全に麻酔され、応答しない場合は、上行大小耳と右心房を露出させるために立体切り術を行う。 メスを使用して、胸部入口で胸骨の上部から中線切開を行い、xiphoidプロセスにダウンさせます。焼灼器(またははさみ)で、胸骨が見えるまで下層の脂肪と筋肉を解剖する。 xiphoidプロセスから、外科的な骨はさみまたは骨のこぎりでマニュブリウムを通して胸骨の中間線を切断する。心臓を露出させるために切開部にレトラクターを挿入します。 18 G針と注射器を使用して右アトリアにヘパリン(300 U/kg)のボーラス用量を提供し、臓器切除時のブロット凝固を最小限に抑えます。心臓の周りに胸腔と氷の中に吸収性パッドを置きます。 はさみで、周膜を慎重にスライスし、周囲の結合組織から鈍い解剖によって大動脈を分離し、大動脈のアーチの最初の動脈枝のすぐ下に大動脈をクランプする。18 G針で50 mLの注射器を使用し、上昇大小突の上部を通して氷冷心プレギア(20 mL/kg)を注入します。 心臓につながる血管を切り取り、上行大動脈をそのままにして心臓を取り除き、切除した心臓を氷冷心麻痺に突き刺す。 大胸の壁をヘモスタのペアでつかみ、心臓の上に吊り下げられた氷冷心プレギアメディアの1 Lにつながるチューブに取り付けられたリブ付きカニューレに滑り込みます(〜95cmは〜70mm Hgを提供します)。気泡が血管系に入るのを防ぐために、流体がオーバーフローするまで大腸に入って満たします。注:機械的アンカプラー(2,3-ブタンジオンモノキシム[BDM]またはブレビスタチン)の使用は、組織の酸素要求が減少するにつれて冠状動脈灌流速度を低下させる。 アンビリカルテープを使用して大腸をカニューレに固定し、さらにカニューレからぶら下がっている心臓の重みに合う止血を結んでアンカーします(図1C)。冷たい媒体が重力を介して70 mmHgの一定の圧力で心臓を逆行させる。温めた(37°)ランゲンドルフ灌流システム(<10分)に移す準備ができるまで、心臓を冷たい心拍痛に浸しておいてください。注:小さい心臓の大小(3/8″内径)を使用して、大小田に入る溶液よりも気泡が速く上昇します。 カニューレに空気を入れることなく、ランゲンドルフシステム(37°)に心臓を移します。正常な静脈のリズムが残りの血液および心プレギアの血管系を洗い流すことを可能にする。注:記載された研究では、単離された若い子豚の心臓で184±17mL/分の平均初期流量が観察された。機械的アンカプラー(20 mM BDM)を含む加温された媒体を注入した後、流量は70±7.5 mL/min(平均±SEM)まで低下した。心臓組織は心臓イメージングに影響を与える可能性があるので、心臓組織を沈めないでください。組織温度は、げっ歯類と比較して、その大きな体積とより小さい表面積のために豚の心臓の冠状流れによって維持されます。フルフロー下では、表脈および内膜温度はそれぞれ35°Cから37°Cの範囲であった。注意:機械的なアンカプラーを使用する場合は、アイウェアを含む適切な個人用保護具を着用してください。心臓は、迅速かつ予期せずメディアを排出することができます。 衝撃的な不整脈(心室頻脈、心室細動)の場合、心臓の頂点と基部に外部パドルを配置し、5 Jで単一のショックを送ることによって心臓を除細動し、5 J刻みで増加する(または選択可能な)除細動器)50 J、カーディオバージョン、または衝撃的でないリズムまで。必要に応じて50 Jで衝撃を繰り返します。注:提示された研究では、製剤の89%が除細動を必要としました。平衡化後(〜10分)、若年子豚の心臓に対して平均心拍数70±4.5bpm(平均±SEM)が観察された(図2)。 再循環することなく、修飾されたクレブス・ヘンセレit媒体の少なくとも1Lで心臓を洗い流し、残りの血液および心プレジアを除去する。メディアが心臓を通して明確に実行されたら、循環ループを閉じて、パーフューサートを再循環させます。 3. 電気生理学研究 研究の過程を通して標準リードII心電図(ECG)を記録するには、29G針電極を頂点近くの心室表膜に取り付け、右心房に別の電極を付けます。差動バイオアンプの正と負の入力をそれぞれ頂点と右のアトリウムに接続します。 右心房に1つの双極刺激電極を取り付け、ペーシングのために両側左心室に第2の双極刺激電極を取り付ける。 電気生理学刺激装置を使用して心臓をペースし、初期電流を拡張期閾値(1−2mA)の2倍に設定し、1ミリ秒のパルス幅35、36に設定する。注:刺激が応答を引き出さない場合、パルス幅は最大2msまで増加し得る。より多くの電流(〜10x)は、大きな同軸電極(双極刺激)で必要とされる。 一貫した刺激応答を確保するために、定義されたペーシングサイクル長さ(PCL)で一連の刺激インパルス(1-2 mA、1ミリ秒のパルス幅)を適用してペーシングしきい値を特定します。注:固有のレートが確立されると、最初のインパルス列車はわずかに短いPCLで始まるかもしれません。 S1−S1またはS1−S2ペーシングトレインのいずれかを用いて余分な刺激ペーシングを行い、後者では6−8インパルス(S1)の列車に続いて単一インパルス(S2)を行った。キャプチャに失敗するまで、S2 PCL を段階的に 10 ミリ秒(200 ミリ秒、190 ミリ秒、180 ミリ秒など)減らします。究極のPCL(すなわち、190ミリ秒)にステップアップし、キャプチャの損失前に最も正確なPCLを見つけるために1ミリ秒間隔で減少します(すなわち、184ミリ秒)。メモ:S1とS2(1-2 mA、1ミリ秒のパルス幅)に同じ刺激パラメータが使用されます。代表的な例については、または以前にブタ心臓の電気生理学測定37に関する値を公開した値を参照してください。 心室有効耐火期間(VERP)を確立するには、横心室の刺激電極を使用して、S2(早期拍動)が心室脱分極を開始する最短のS1-S2間隔を特定します。注:耐火期間は、最短達成可能なS1-S2カップリング間隔です。 Wenckebachサイクル長(WBCL)を定義するには、右心房の刺激電極を使用して、通常の伝導経路を介して1:1の心室伝導が伝播する最短のS1-S1間隔を見つけます。注:そうしないと、2度の心臓ブロックを表します。 正期節回復時間(SNRT)を定義するには、右心房の刺激電極を使用してペーシングトレイン(S1-S1)を適用し、ペーシングトレインの最後のインパルスと自発的な正心節媒介活性の回復との間の時間遅延を測定します。 房室ノード有効耐火期間(AVNERP)を確立するには、右心房の刺激電極を使用して、早期心房刺激の後にQRSを引き出すHisバンドル電位が続く最短のS1−S2結合間隔を見つける心室脱分極を意味する複合体。 4. 膜貫通電圧と細胞内カルシウムの光学マッピング 注:機械的アンカプラーは、光マッピング中のモーションアーティファクトを最小限に抑え、低酸素3、38、39、40を避けるために使用する必要があります。(-/-)ブレビスタチン(5μM循環濃度)は、5mLのフルフスエート(最終濃度100x)41中で0.5mMのボーラス用量としてゆっくりと添加してもよい。あるいは、BDMは、最初は20mMの循環濃度で浸透性媒体に含まれていてもよい。 RH237の5mgを無水DMSOの4mLに溶解して電圧色素を調製する。最大5mLのメディアと渦で色素アリコートを希釈します。RH237(500mLの食液量当たり62.1μg)を大動脈カニューレに近位にゆっくりと加えます。注:心筋組織は、実験期間中、必要に応じてRH237で再染色され得る。 1mgのRhod2-AMを無水DMSOの1mLに溶解してカルシウム色素を調製する。50°Lのプルロン酸で染料を混ぜ、37°超音波浴中に10分間入れ、最大5mLの媒体で希釈します。カルシウム色素(500mLの浸透液)を大動脈カニューレに近位にゆっくりと加えます。注:均一な染料染色を確保するために、染料をゆっくりと添加する必要があります(>30s)。Rhod-2AMはピーク蛍光に達するまでに最大10分かかりますが、RH237は1~2分以内に心臓を汚します。SNR 値は、SNR = (ピークからピーク数)/(拡張期間隔時の標準偏差)42として計算できます。 図 1に示すように、イメージング ハードウェア (カメラ、イメージ スプリッタ、レンズ) を配置して、適切な視野に焦点を当てます。注:スプリッタは、RH237 を通過し、Rhod2 発光スペクトルを反映するダイクロイック ミラー(660+ nm)で構成されています。RH237(710 nmロングパス)およびRhod2(585±40nm)放出光(ロングパスET710、材料表を参照)には、高透過発光フィルタが使用されます。ワイド瞳50mm/F0.95lレンズを画像スプリッタの前面に取り付けます。この構成により、以前に検証された43,44に従って、十分な発光光分離が得られます。 カメラをワークステーションに接続し、選択したソフトウェアを使用して画像を取得し、露出時間を 0.5 ~ 2 ミリ秒にします。ハイライトの不整列に加えて(「ソフトウェアのマテリアルの表」オプションを参照)。 周囲の照明からの蛍光干渉を最小限に抑えるために、室内のライトをオフにします。イメージング開始前にLEDライト(525 nm、1.4 mW/mm2)をテストし、センサーの深さによって決定される均一で最大の心筋照明を確保します。注:各光は励起フィルタ(535±25 nm)を介して向けられる。LEDライトは、信号の直線性を最大化するために、撮影前に手動でトリガすることができます。表膜から放出された蛍光は、画像スプリッタおよび発光フィルタを通過する。スプリット画像は高速センサーに投影されます。視野は、レンズの選択と心臓からの距離に応じて、分割画像ごとに約12cm x 10cm、または5.9 cm x 4.7 cmです。 光マッピング研究では、正期リズム時の心筋、心室細動(図4)または動的ペーシング(S1−S1、1−2mA、1ミリ秒のパルス幅)を左心室に配置された刺激電極を介して画像化する(図5)。350 ミリ秒のペーシング サイクル長から開始し、10 ~ 50 ミリ秒ずつ減少して払戻曲線を生成する (図 5E)35,36. 5. クリーンアップ システムから心臓を取り除き、すべての排液を排出します。精製水でシステムチューブとチャンバーをすすいでください。 定期的なメンテナンスのために、必要に応じて、洗剤溶液または希釈過酸化水素溶液でシステムを定期的に洗い流します。 6. データ処理 ビデオファイルを開き、対象地域を選択し、適切なソフトウェアパッケージまたはカスタムアルゴリズムを使用して時間の経過に伴う蛍光をプロットして、研究全体を通じて光信号の品質を確認します。 前述の23、33、43、45、46、活性化時間を含む作用電位およびカルシウム過渡時間パラメータを定量化するために、前に説明したように画像データを分析し、電圧-カルシウム結合時間(VmとCaの活性化時間の差)、および再分極持続時間の測定。 しきい値を適用して蛍光心膜ピクセルを分離し、騒がしい背景データを破棄します。注:しきい値を使用すると、大きな動画の分析が簡素化され、高速化されます。 図 4および図 5に示すように、3 mm x 3 mm から 5 mm x 5 mm の範囲のカーネル サイズを持つ心身表面積上の光信号を空間的にフィルタリングします。注:後者は、作用電位特徴、カルシウム過渡形態、または波面19、47の全体的な輪郭を歪めることなくSNRを改善する。これは、大きなピクセルのセンサーを使用する場合や、取得中にビニングする場合は不要な場合があります。 デジタルローパスフィルタ(例えば、5次バターワース)で信号を100~75Hzのカットオフ周波数で時間的にフィルタリングし、重要でない信号内容を排除する。注:代表的な処理済みトレースの例については、図 5Cを参照してください。 N 次多項式フィッティングを使用してドリフト除去と減算を適用し、光漂白、モーション、またはその他の重要な変動源の影響を最小限に抑えます。 ビデオ全体にわたる光学データの処理と正規化の後、目的の作用電位とカルシウム過渡パラメータを計算します。脱分極時の最大誘導体の時間として定義された活性化時間を決定し、再分極化率と期間を計算するために蛍光ピーク(作用電位持続時間[APD]および[Ca2+]i持続時間[CaD])を参照図 5)。 時間パラメータを計算した後、カスタムアルゴリズム23、33を使用して、画像化された心筋表面全体にわたる単一の作用電位またはカルシウム過渡の側面を描写するアイソクロナルマップを生成します。43、45、46 .注:例については、図 5Dを参照してください。