JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

אופקרדיוגרפיה ולימודי אלקטרופיזיולוגיה של לשעבר Vivo נגדורף

Published: November 07, 2019
doi:
10.3791/60472
, , , , , , , , ,
1Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation,Children’s National Hospital, 2Children’s National Heart Institute,Children’s National Hospital, 3Center for Neuroscience Research,Children’s National Hospital, 4Department of Biomedical Engineering, School of Engineering,University of Alabama at Birmingham, 5Department of Pediatrics, Department of Pharmacology & Physiology, School of Medicine and Health Sciences,George Washington University

Summary

מטרת מחקר זה הייתה ליצור שיטה לחקירת דינמיקה קרדיולוגית באמצעות מודל בעלי חיים טרנסלבותית. הגישה הניסיונית המתוארת משלבת אופקרדיוגרפיה כפולה בשילוב עם מחקר אלקטרולוגי להערכת פעילות החשמל במודל לב פורצין מבודד, שלם.

Abstract

מודלים בעלי חיים קטנים משמשים בדרך כלל במחקר לב וכלי דם בשל הזמינות של מינים שהשתנו גנטית ועלות נמוכה יותר בהשוואה לבעלי חיים גדולים יותר. ובכל זאת, יונקים גדולים יותר מתאימים יותר לשאלות מחקר טרנסלאליות הקשורות לפיזיולוגיה לב נורמלית, פתופסולוגיה ובדיקות טרום-קליניות של סוכנים טיפוליים. כדי להתגבר על המחסומים הטכניים הקשורים לשימוש במודל בעלי חיים גדול יותר במחקר קרדיולוגי, אנו מתארים גישה למדידת הפרמטרים הפיזיולוגיים של לב חזרזיר מבודד, לאנגדורף. גישה זו משלבת שני כלים ניסיוניים רבי עוצמה להערכת מצב הלב: אלקטרופיזיולוגיה (EP) לימוד ומיפוי אופטי סימולטני של מתח טרנסממברני וסידן תאיים באמצעות צבעים תלויי פרמטרים (RH237, Rhod2-AM). המתודולוגיות המתוארות מתאימות היטב למחקרים טרנסלטיניים החוקרים את מערכת ההולכה הקרדיולוגית, שינויים במבנה הפוטנציאלי לפעולה, טיפול בסידן, התכווצות-כיווץ צימוד והשכיחות של לסירוגין לב או פרעות קצב.

Introduction

מחלות לב וכלי דם היא גורם מוביל למחלות ומוות ברחבי העולם. ככזה, מוקד מחקר ראשוני הוא לייעל מתודולוגיות שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד פיזיולוגיה לב נורמלי המנגנונים הבסיסיים שיכולים לתרום לתחלואה ותמותה אצל בני אדם. מחקר לב וכלי דם בסיסי הסתמך באופן מסורתי על דגמים קטנים של בעלי חיים, כולל מכרסמים וארנבים1,2,3, בשל הזמינות של זנים ששונו גנטית4,5, בעלות נמוכה יותר, כאשר שטח ניסיוני קטן יותר ותפוקה גבוהה יותר. עם זאת, השימוש במודל חזיר יש את הפוטנציאל לספק נתונים הרלוונטיים יותר קלינית6. אכן, מחקרים קודמים תיעדו את קווי הדמיון של האלקטרופיזיולוגיה לב (EP) בין בני אדם וחזירים, כולל זרמי יונים דומים7, צורה פוטנציאלית פעולה8, ותגובות בדיקה פרמקולוגית9. כמו-כן, ליבו של הפורצין יש קינטיקה והרפיה מרגיעה, הדומים יותר לבני האדם מאשר למכרסמים או לארנבים10. לעומת מודל כלבים, אנטומיה כלילית חזירי דומה יותר ללב האנושי11,12 והוא המודל של בחירה עבור מחקרים התמקדו התפתחות לב, ילדים קרדיולוגיה ו/או מומים לב מולדים 13. למרות שיש הבדלים בין חזיר לבן אדם8, קווי דמיון אלה להפוך את הלב חזירי מודל רב ערך עבור מחקר לב וכלי דם14.

הפרזיה של הלב הפכה לפרוטוקול סטנדרטי עבור לימוד הדינמיקה של הלב לשעבר vivo15 מאז שהוקמה על ידי אוסקר לנגדורף16. בהתאם לכך, ניתן להשתמש ב לאנגדורף-פרזיה לתמיכה בלב מבודד ללא שינוי בהעדר השפעות אוטונומיות. מודל זה הוא כלי שימושי להשוואת השוואת הפיזיולוגיה של הלב והאנטי-לבבות בריאים ושאינם בריאים. מאחר והדינמיקה הקרדיולוגית הן מורכבות זמנית והן מורכבת ביותר, שינוי קל באזור אחד יכול להשפיע באופן דרמטי על יכולתו של לב כולו לעבוד כסינציציום17. לכן, הדמיה גבוהה בזמני של צבעים תלויי פרמטרים הוא כלי שימושי עבור ניטור תפקוד הלב על פני השטח של הלב18,19. ואכן, הדמיה במקביל כפול של מתח ובדיקות פלורסנט רגישות סידן מאפשר להעריך את פעילות החשמל, טיפול בסידן, התכווצות עירור מצמד ברמת הרקמה20,21, 22,23,24,25,26,27,28. לנגדורף-perfusion ו/או טכניקות מיפוי אופטי שימשו בעבר כדי לתעד את הירידה בביצועי הלב בשל הזדקנות או מוטציות גנטיות, כדי להעריך את הבטיחות של סוכני תרופתי או חשיפות סביבתיות29 ,30,31,32,33.

במסגרת המחקר הקליני, מחקר האלקטרופיזיולוגיה של הלב פולשנית משמש לעתים קרובות כדי לחקור הפרעות קצב לב, זיהוי פתווגיות, ולהצביע אפשרויות טיפול אפשריות. באופן דומה, אנו מתארים פרוטוקול EP שניתן להשתמש בו כדי להעריך את פונקציית הצומת סינוס, למדוד הולכה מראש, ולזהות את refractoriness של רקמת שריר הלב. המחקר המתואר EP ניתן לבצע בשילוב עם מיפוי אופטי, או אלקטרואופטיקה34, כדי לאפיין באופן מלא פיזיולוגיה לב בלבבות מבודדים. בפרוטוקול המתואר, ברזולוציה גבוהה זמן דמיה פלואורסצנטית בוצעה עם שילוב של מתח (RH237) ו סידן (רוד-2am) צבעים בכיוונון פליטה כפול. בנוסף, הפרמטרים של האלקטרופיזיולוגיה של הלב היו תחת שניהם קצב סינוס ובתגובה גירוי חשמלי מתוכנת.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם למכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים (המהדורה השמינית). כל השיטות והפרוטוקולים המשמשים במחקרים אלה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש ועדת הפרוטוקול בבית החולים הלאומי לילדים בעקבות ההנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסמו על ידי NIH. כל החיות המשמשות במחקר זה קיבלו טיפול הומאני בציות למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. 1. הכנה להכין 6 L של שונה קרמבו-Henseleit פתרון16 (mM: 118.0, 3.3 kcl, 1.2 MgSO4, 24.0 נחקו3, 1.2 KH2PO4, 10.0 גלוקוז, 2.0 נתרן פירובט, 2% אלבומין, 2.0 cacl2). הוסף CaCl2 ביום של הניסוי, מאז לאורך זמן, בנוכחות פוספטים, סידן כלוריד יהיה מזרז סופני מתוך הפתרון כמו סידן פוספט. להתאים את ה-pH ל 7.4 לאחר סינון סטרילי (גודל נקבובית: 0.22 μm). בדקו את התמיסה האוסמאליות כדי להבטיח מגוון של 275-310 מוsm/ק”ג. מגניב 1 L על הקרח לשימוש מיד לאחר הלב הוא מגורש. חם 3 L באמבט מים כ 37 ° c לפני מבעבע עם קרבוגן (95% O2, 5% CO2).הערה: התחממות ממזער בועות ותסחיף פוטנציאלי, מאז נוזל קר יש קיבולת מוגברת של גז להתמוסס; לכן, כמו מדיה krebs-henseleit שונה עובר דרך מערכת זלוף ומחמם, הגז ישוחררו כמו בועות. הכינו 2 ליטר של שיטת החייאה (פתרון משתנה של דל נידו, שולחן 1). להקפיא מספיק קרדיוגרם בתוך מגש של קוביות קרח כדי למלא גביע 500 mL. הפעל את אמבטיות המים המופצות עד 42 ° c. הפעל את המשאבות כדי לסובב את החומר בלולאה שנסגרה לחימום הידריוני (לרשימה מלאה של חומרים, ראה שולחן חומרים ואיור 1).הערה: אמבט מים במחזור מחומם משמש לחימום צינורות המים ומחליפי החום. ניקוי מעגלים ותאי אבובים על ידי ריצה 2 L של 1% פתרון של אבקת כביסה אוניברסלית במים דרך המערכת. שטפו את כל מעגלי האבובים והתאים של מערכת לנגדורף עם > 4 L של מים מטוהרים. הפעל משאבות עד שכל המים הוסרו מהמערכת. הוסף מסנן קרום סינתטי בקנה אחד עם משאבות פרפיוז (סינון פוליפרופילן, גודל נקבובית > 5 μm). גז חמצן מיקרופייבר (הומופילטר) עם 95% O2 ו 5% CO2 ב 80 kPa.הערה: בעת שימוש אלבומין, יש לעתים קרובות משהו מקושר עם חמצן ו/או פעילות שאיבה דרך מעגל אבובים. תרכובת נגד קצף (נגד קצף) ניתן להוסיף dropwise מעת לעת (~ כל 30 דקות) כדי להרוות אותו כפי שהוא מתרחש. בדוק כיול שתי נקודות (0 ו-60 mmHg) עבור חיישן הלחץ הממוקם מעל אבי העורקים או במלכודת הבועה; כייל כנדרש. מיד לפני כריתה של הלב, יוצקים את התקשורת למערכת ההיתוך של לאנגדורף. ודא כי הגורם עובר באמצעות חמצן מיקרופייבר (הומופילטר) בגז עם מבשם חמצן, אשר זורם לאחר מכן באמצעות מחליפי חום כדי לשמור על טמפרטורת מדיה של 37 ° c על העורקים. הגדר את אמבטיית המים הזורמים לכמה מעלות גבוהה יותר מ-37 ° c, כגון 42 ° c, כדי להסביר את אובדן החום במהלך ההחלפה וברחבי המערכת. מפקחים על טמפרטורת הכיוון המחזורי עם זוגות תרמיים. 2. לב כריתה ולנגדורף-פרזיה לסמם את החזיר עם הזרקת שרירי (הארה) של קטמין (20 מ”ג/ק”ג) ו-xylazine (2 מ”ג/ק”ג) ו-צנרור עם צינורית אנדוקנה. עבור אינדוקציה, לספק הזרקת בולוס עירוי של פנטניל (50 μg/ק”ג) ו rocuronium (1 מ”ג/ק”ג). שמרו על הרדמה בעזרת שאיפה איזואופלוראנה (0.5-3%), פנטניל (10 או 25 μg/ק”ג) ו-פנקרוניום (1 מ”ג/ק”ג).הערה: עבור מחקר ההוכחה העקרונית, חזירים צעירים (14-42 ימים, n = 18) שימשו בין 2.5 ל-10.5 ק”ג משקל גוף ו -18 משקל לב (איור 2). אם הזרקה נוספת עבור אינדוקציה הוא הכרחי, קטמין (10 מ”ג/ק”ג) ניתן להזריק הודעת המשך ברגע שהחיה מורדם לחלוטין ואינה מגיבה, בצע כריתת אונה לחשיפת העורקים הימניים והפרוזדור הימני. בעזרת אזמל, הפוך את קו האמצע לחתך מראש עצם החזה בשקע בית החזה, עד לתהליך xiphoid. עם הבית (או מספריים), לנתח את השומן הבסיסי השריר עד עצם החזה גלוי. מתהליך xiphoid, לחתוך את עצם החזה באמצע למעלה דרך הנובריום עם מספריים עצם כירורגית או מסור עצם. הכניסו טרקטורים לתוך החתך כדי לחשוף את הלב. העבר מנה מינון של הפארין (300 ק ג) ימינה, בעזרת מחט ומזרק של 18 גרם, כדי למזער קרישי דם על כריתה של איברים. מניחים רפידות ספיגה בחלל החזה והקרח מסביב ללב. עם מספריים, לחתוך בזהירות דרך קרום הלב, לבודד את אבי העורקים על ידי ניתוח קהה של רקמת החיבור המקיפים, ולהדק את אבי העורקים ממש מתחת להסתעפות העורקים הראשונה על קשת אבי העורקים. באמצעות מזרק 50 mL עם מחט של 18 גרם, להזריק הלגיון קר קרח (20 מ ל/ק”ג) דרך החלק העליון של העורקים העולה. חותכים את הכלים המובילים ללב ומסירים את הלב עם העורקים העולים ללא פגע ומוציאים את הלב החותך לתוך כלבי העגל הקפוא. לתפוס את קירות העורקים עם זוג הומוסטטיסטיקה ולהחליק אותו על צינורית משונן מחוברת אבובים המוביל ל 1 L של מדיה הקרה קרח קר הושעה מעל הלב (~ 95 ס מ כדי לספק ~ 70 מ”מ Hg). אפשר לנוזלים להיכנס ולמלא את העורקים עד שהוא יגלוש כדי למנוע מבועה להיכנס לתוך הכלי.הערה: שימוש של uncoupler מכני (2, 3-butanedione מונוקסימי [bdm] או בליבסטטין) יקטין את שיעור זלוף כלילית כדרישת החמצן של ירידות רקמות. אבטחו את העורקים אל הצינורית בעזרת סרט הטבור והרימו אותו עוד יותר על-ידי קשירת הדימום על מנת לשאת את משקל הלב, התלוי כעת בצינורית (איור 1C). אפשר לאמצעי התקשורת הקרים לשתק את הלב בלחץ תמידי של 70 מע דרך כוח הכבידה. השאר את הלב מתחת לפני הרוח הקרה עד שהוא מוכן להעברה למערכת 37 ההיתוך (< 10 דקות).הערה: העורקים על לבבות קטנים יותר ( 3/8 “קוטר פנימי) אשר מאפשר בועות לעלות מהר יותר מאשר הפתרון הזנת העורקים. העבירו את הלב למערכת לנגדורף (37 ° c) בלי להכניס אוויר לתוך הצינורית. הרשו לקצב הסינוס הרגיל לשטוף. את הצינור של דם שנותרהערה: במחקר המתואר ממוצע הזרימה הראשונית שיעור של 184 ± 17 mL/min נצפתה בודדים חזרזיר לנוער לבבות. קצב הזרימה ירד ל 70 ± 7.5 mL/min (ממוצע ± SEM) לאחר מבשם עם מדיה מחומם המכיל uncoupler מכני (20 מ”מ BDM). אין להטביע את רקמת הלב, משום שהיא יכולה להדחות על דימות לב. טמפרטורת הרקמה מתוחזק על ידי זרימת כלילית בלב החזיר בשל נפח גדול יותר ושטח שטח קטן יותר, לעומת מכרסמים. במהלך הזרימה המלאה, הטמפרטורות האפיליקרינה והאנקרדיום נעו מ-35 ° צ’ עד 37 ° c, בהתאמה.זהירות: לובשים ציוד הגנה אישי מתאים, כולל ללבוש עיניים כשעובדים עם uncouplers מכני. הלב יכול להוציא מדיה. במהירות ובמפתיע תנו את הלב במקרה של הפרעות קצב שהלם (טכיקרדיה חדרית, החדרית פרוזדורים) על ידי הצבת משוטים חיצוניים על הפיסגה ואת הבסיס של הלב ואספקת זעזוע אחד ב 5 J, הגדלת 5 J במרווחים (או כפי שניתן לבחירה על ידי דפיברילטור) עד 50 J, לב או קצב בלתי שניתן להלם. חזור על הזעזועים ב 50 J לפי הצורך.הערה: במחקר המוצג, 89% ההכנות הנדרשות דפיברילציה. לאחר שיווי משקל (~ 10 דקות), קצב לב ממוצע של 70 ± 4.5 bpm (ממוצע ± SEM) נצפתה לבבות חזרזיר נעורים (איור 2). שוטפים את הלב עם לפחות 1 L של התקשורת Krebs-Henseleit שונה, בלי לדבר באופן מידי, כדי להסיר דם שיורית וקרדיוכימיה. ברגע שהתקשורת מופעלת ברור דרך הלב, לסגור את הלולאה לחזור לתקן מבשם. 3. מחקר אלקטרופיזיולוגיה כדי להקליט מוביל סטנדרטי השני אלקטרוג ‘ אק (א) במהלך המחקר, לצרף 29 גרם מחט מחטים אל האפידיום החדרית ליד הפיסגה, עם אלקטרודה אחרת בפרוזדור הימני. חבר את התשומות החיוביות והשליליות של מגבר bioamplifier אל הפיסגה והאטריום הימני, בהתאמה. לצרף אחד הגירוי הדו דו-קוטבית על הזכות atria, ו מניע דו קוטבית השני האלקטרודה אל החדר השמאלי לרוחב למטרות התנועה. לפייס את הלב באמצעות מגירוי אלקטרופיזיולוגיה, עם הנוכחי להגדיר כפליים הסף הדיאסטולי (1-2 mA) ו 1 ms הדופק רוחב35,36.הערה: אם הגירוי לא מצליח לעורר תגובה, רוחב הדופק יכול להיות גדל עד 2 ms. יותר עדכני (~ 10x) יש צורך עם אלקטרודות קואקסיאליים גדול (גירוי דו קוטבית). זיהוי סף התנועה על-ידי החלת סדרה של דחפים מסוימים (1-2-mA, 1 אלפיות-שתיים) באורכי מחזור מוגדרים (PCL) כדי להבטיח תגובת גירוי עקבית.הערה: לאחר הקמת שיעור מהותי, רכבת הדחף הראשונית עשוי להתחיל PCL קצר מעט יותר. באמצעות הרכבת השנייה, הצעדים האחרים מבצעים הרבה מאוד הרבה מאוד שימוש ב-S1 או ב-s1. להקטין את S2 PCL באמצעות 10 ms (כלומר, 200 ms, 190 ms, 180 ms, וכו ‘) עד שהוא נכשל ללכוד. צעד עד ה-PCL האולטימטיבי (כלומר, 190 ms) וירידה במרווחי זמן של 1 ms כדי למצוא את PCL המדויקת ביותר לפני אובדן לכידת (כלומר, 184 ms).הערה: הפרמטרים הזהים של הגירוי משמשים עבור S1 ו-S2 (1 עד 2 מילי-אם, 1 ברוחב הפולס). ראה איור 3 עבור דוגמאות מייצגים, או ערכים שפורסמו בעבר על מדידות חזירי לב אלקטרופיזיולוגיה37. כדי לקבוע את התקופה היעילה והעקשן של המוח (VERP), השתמש באלקטרודה גירוי על החדר השמאלי לרוחב כדי לזהות את הפרק הקצר ביותר S1-S2 שבו S2 (בטרם עת) יוזם depolarization.הערה: התקופה העקשן הוא מרווח הזמן הקצר ביותר השגה של הזיווגים-S2. כדי להגדיר את אורך מחזור Wenckebach (WBCL), להשתמש באלקטרודה גירוי על האטריום הימני כדי למצוא את המרווח הקצר ביותר S1-S1 שבו 1:1 מכבש ההולכה הארוך מפיץ דרך מסלול ההולכה הרגיל.הערה: כישלון לעשות זאת מייצג בלוק2 מעלות לב. כדי להגדיר את זמן ההתאוששות של צומת סינוס (SNRT), להשתמש באלקטרודה גירוי על האטריום הימני כדי להחיל רכבת התנועה (S1-S1) ולמדוד את העיכוב זמן בין הדחף האחרון ברכבת התנועה, ואת ההתאוששות של פעילות הצומת הספונטנית בתיווך. כדי לקבוע הצומת מלוח מלוח אפקטיבי התקופה עקשן (AVNERP), השתמש באלקטרודה גירוי על האטריום הימני כדי למצוא את המרווח הקצר ביותר S1-S2 מרווח שבו גירוי הפרפור מוקדם ואחריו הפוטנציאל הצרור שלו שמבצע QRS מורכב, שאינו מסמל את המוח הדפולריזציה. 4. מיפוי אופטי של מתח טרנסממבראני וסידן תאיים הערה: מצמד מכני צריך לשמש כדי למזער את ממצאים התנועה במהלך מיפוי אופטי, כדי למנוע היפוקסיה3,38,39,40. (-/-) בלייסטטין (5 הריכוז במחזור μM) ניתן להוסיף באיטיות כמינון ההזנה של 0.5 מ”מ ב 5 מ מ של מבשם (100x של ריכוז סופי)41. לחילופין, BDM עשוי להיכלל בתחילה בתקשורת החומרים בריכוז מחזורי של 20 מ”מ. הכינו את צבע המתח על ידי המסת 5 מ ג של RH237 לתוך 4 מ ל של הידרוסו DMSO. לדלל את הצבע עם עד 5 מ ל של מדיה ומערבולת. לאט להוסיף RH237 (62.1 μg לכל 500 mL של מבשם) האבויה לצינורית אבי העורקים.הערה: רקמת שריר הלב יכול להיות מוכתם מחדש עם RH237, אם יש צורך, לאורך זמן הניסוי. הכינו את צבע הסידן על ידי המסת 1 מ”ג של Rhod2-AM לתוך 1 מ ל של DMSO. מערבבים את הצבע עם 50 μL של חומצה פלורליסטית, מקום באמבט 37 ° c sonicating עד 10 דקות, ולאחר מכן לדלל עם עד 5 מ ל של מדיה. לאט להוסיף את צבע הסידן (50 μg לכל 500 mL של מבשם) האבויה לצינורית אבי העורקים.הערה: כדי להבטיח כתמים לצבוע אחיד, יש להוסיף צבעים באיטיות (> 30 s). רוד-2AM לוקח עד 10 דקות כדי להגיע לשיא הזריחה, בעוד RH237 כתמי את הלב בתוך 1-2 דקות. באמצעות טעינת הצבע המתוארת, האות ליחס הרעש (SNR) טווחים של ~ 42-86 ו-~ 35 ל-69 עבור מתח וסידן, בהתאמה, ניתן לצפות. ניתן לחשב ערכי SNR כ-SNR = (ספירות שיא לשיא)/(סטיית תקן במהלך מרווח הזמן הדיאסטולי)42. הצב את חומרת הדימות (מצלמה, מפצל תמונה, עדשה) כמוצג באיור 1, כדי להתמקד בשדה תצוגה מתאים.הערה: המפצל מוגדר עם דיקרואיק mirror (660 + nm) העובר RH237 ומשקף את ספקטרום הפליטה Rhod2. מסנני פליטה בשידור גבוה משמשים לRH237 (710 ננומטר למעבר ארוך) ו-Rhod2 (585 ± 40 nm) האור הנפלט (מעבר ארוך ET710, ראה טבלת חומרים). העדשה רחב-תלמידה 50 mm/F 0.95 l מחוברת לחזית מפצל התמונה. תצורה זו תוצאות הפרדת האור בפליטת הנאות, כפי שאומת בעבר43,44. חבר את המצלמה לתחנת עבודה ולרכוש תמונות באמצעות התוכנה שנבחרה, עם זמן חשיפה של 0.5-2 אלפיות הראשונה. בצע יישור תמונה בעזרת תוכנה שיכולה לפצל את האזורים הרצויים, את הכיסוי, ולהציג חיסור בקנה מידה אפור או צבע מדומה נוסף לסימון שגוי (ראה טבלת חומרים לתוכנה). כבו את אור החדר כדי למזער הפרעות הזריחה מתאורת הסביבה. בדוק את נורות ה-LED (525 nm, 1.4 mW/mm2) לפני תחילת ההדמיה כדי להבטיח התאורה מקסימלית ואפיארחיוג מקסימלי, כפי שנקבע על ידי החיישן עומק היטב.הערה: כל אור מופנה דרך מסנן עירור (535 ± 25 ננומטר). נוריות LED ניתן להפעיל באופן ידני לפני הצילום כדי למקסם את יניאריות האות. הזריחה הנפלטת מהאפידיום עוברת דרך מפצל התמונות ומסנני הפליטה. תמונות מפוצלות מוקרן על חיישן במהירות גבוהה. שדה התצוגה הוא כ 12 ס”מ x 10 ס”מ, או 5.9 ס”מ x 4.7 ס מ עבור כל תמונה מפוצלת, בהתאם לבחירה בעדשה ומרחק מלב. עבור לימודי מיפוי אופטי, התמונה שריר הלב במהלך קצב סינוס, פרפור פרוזדורים (איור 4) או צעדים דינאמיים (S1-s1, 1 על 2 אם, 1 ms רוחב הדופק) באמצעות אלקטרודה גירוי ממוקם על החדר השמאלי (איור 5). התחל עם אורך מחזור התנועה של 350 ms, והקטן על ידי 10-50 מילישניות כדי ליצור הפיצויים עקומות (איור 5e)35,36. 5. ניקוי להסיר את הלב מהמערכת ולנקז את כל החומר. לשטוף את צינורות המערכת ואת התאים עם מים מטוהרים. עבור תחזוקה שגרתית, מדי פעם לשטוף את המערכת עם תמיסת ניקוי או חמצן מימן מדולל פתרון, לפי הצורך. 6. עיבוד נתונים אשר איכות אות אופטית במהלך המחקר על-ידי פתיחת קובץ וידאו, בחירת אזור מעניין, והתוויית ממוצע של זריחה לאורך זמן באמצעות חבילת תוכנה מתאימה או אלגוריתם מותאם אישית. ניתוח נתוני הדמיה כמתואר בעבר23,33,43,45,46, כדי לכמת את הפוטנציאל לפעולה הזמן והסידן משתנים זמניים, כולל ההפעלה time, מתח הזמן צימוד סידן (ההבדל בין זמני ההפעלה של Vm ו-Ca), ומדידות משך הזמן רה-פולריזציה. החל מסף לבודד פיקסלים בעלי פלורסנט פלואורסצנט ולמחוק נתוני רקע רועשים.הערה: סף לפשט ולהאיץ ניתוח על פני קטעי וידאו גדולים. מסננים spatially אותות אופטיים מעל פני שטח הפנים האפילחייג עם גדלי ליבה החל 3 מ”מ x 3 מ”מ עד 5 מ”מ x 5 מ”מ, כפי שנראה באיור 4 איור 5.הערה: האחרון ישפר את הSNR מבלי לעוות את התכונות הפוטנציאליות של הפעולה, מורפולוגיה ארעית של סידן, או מתאר כללי של חזיתות גל19,47. זה עשוי להיות מיותר אם באמצעות חיישן עם פיקסלים גדולים או אם binning במהלך הרכישה. מסנן באופן זמני אותות עם מסנן lowpass דיגיטלי (למשל, 5-הזמנה בחמאה) עם תדר החיתוך בין 100 ו 75 הרץ כדי למנוע משמעות האות תוכן45.הערה: ראה איור 5C לדוגמה של עקבות מעובדים מייצגים. להחיל הסרת הסחף וחיסור, באמצעות n-התאמה פולינומיאלית, כדי למזער את ההשפעות של הלבנת, תנועה, או מקורות משמעותיים אחרים של וריאציה. לאחר עיבוד ונורמליזציה של נתונים אופטיים על-פני וידאו שלם, חשב את פוטנציאל הפעולה ואת הפרמטרים הזמניים של מערכות העניין. קבע את זמן ההפעלה, המוגדר כזמן הנגזרת המרבית במהלך הדפולריזציה, ומעבר לזריחה כדי לחשב שעות נוספות ונקודות באחוזים (משך זמן פוטנציאלי של פעולה [APD] ו-[Ca2 +] i משך זמן [CaD], ראה איור 5). לאחר חישוב הפרמטרים הזמניים, צור מפות איזוכרום כדי לתאר היבטים של פעולה בודדת פוטנציאל או סידן חולף על פני פני השטח האפיליdial כולו באמצעות אלגוריתמים מותאמים אישית23,33, 43,45,46.הערה: ראה איור 5D לדוגמה.

Representative Results

איור 1A מראה דיאגרמה של מערכת היתוך לב מבודדת, הכוללת את מעגל אבובים, משאבה, מסנן, חמצן, מאגרים וגופי חימום. מיקום התצורה של ה-א (הקצה השני) ואלקטרודות התנועה מוצגים באיור 1B, והגדרת ההדמיה מתוארת באיור 1b. תרשים סכמטי של הרכיבים האופטיים והנתיבים הקלים מוצגים באיור 1D. מחקרים ניסיוניים בוצעו על שלמות, לבבות שלמים מבודדים שרקנים צעירים (14-42 ימים, n = 18) כי נע בגודל של 2.5-10.5 ק”ג משקל הגוף ו 18-137 g משקל לב (איור 2A). לאחר העברת הלב המבודד למערכת לאנגדורף (37 ° c), קצב הלב התייצב 70 ± 4.5 bpm (ממוצע ± SEM) בתוך ~ 10 דקות של דפיברילציה ונשאר קבוע במשך המחקר (איור 2B). קצב הזרימה הממוצע של 184 ± 17 מ ל/דקה (ממוצע ± SEM) נמדד, אשר הואט 70 ± 7.5 mL/min לאחר הירי עם מדיה מחומם המכיל מצמד מכני (איור 2C). להוביל II ECGs נרשמו לאורך כל תקופת המחקר במהלך קצב סינוס (איור 3A) או בתגובה הצעדים החיצוניים (איור 3ב-E) כדי לכמת פרמטרים אלקטרופיסיולוגיים. עבור הערכת EP, התנועה דינמי (S1-S1) הוחל על האטריום הימני כדי להצביע על WBCL ו SNRT (זמן התאוששות לאחר S1-S1 מתחילה, איור 3C), שבו WBCL היה מסומן PCL הקצר ביותר כי יזם פרפור הולכה חדרית. פרוטוקול S1-S2 התנועה יושם באמצעות אלקטרודה הגירוי דו-קוטבית על החדר השמאלי כדי לזהות את מרווח הזמן הקצר ביותר הצימוד שיזם depolarization חדרית, ובכך הצביע VERP (איור 3D). לחילופין, הפרוטוקול S1-S2 התנועה מוחל על האתר AVNERP (S1-S2), כפי שמוצג באיור 3E. דוגמאות מייצגות של הפרמטרים של הלב החזיר האלקטרופיזיולוגיה ליישר עם אלה שפורסמו בעבר37. ניסויי מיפוי אופטי בוצעו במהלך קצב סינוס, פרפור פרוזדורים (איור 4), או במהלך התנועה דינמי (S1-s1) של החדר השמאלי (LV) כדי ליצור הפיצויים החשמל והסידן עקומות מתוארים ב . איור 5 תמונות מייצגות של לב שנטען לצבע חזרזיר מוצגים באיור 4 עם פוטנציאל הפעולה האופטי המקביל (Vm) ו סידן (Ca) ארעיות שנאספו שני אזורים של עניין על משטח האפיארלחייג (חדר ימני [RV] = כחול, LV = אדום) . אותות לא מעובד מוצגים במהלך קצב סינוס ובמהלך פרוזדורים חדרית. כפי שהוזכר קודם לכן, במהלך ניסויים מיפוי אופטי (S1-S1) נעשה שימוש גם במהלך ניסויי המיפוי האופטיים כדי לנרמל כל הבדל קל בקצב הלב הפנימי (איור 5א-ה). אותות גולמיים מוצגים (RV = כחול, LV = אדום), אשר שימשו כדי לתאר את פוטנציאל הפעולה-הזמן הצימוד סידן זמני (איור 5C), ההפעלה והמשך זמן (איור 5c), החשמל והסידן לפיצוי (איור 5c). עבור ההכנות שריר הלב עבה, סינון מרחבי עם גודל הקרנל ~ 3 מ”מ x 3 מ”מ מתאים הפוטנציאל פעולה אפיארחיוג פוטנציאלי או סידן ניתוח חולף19,47. לפיכך, תמונות ברזולוציה מרחבית גבוהה (ב ההתקנה המתוארת 1240 x 1024 הכולל, או 620 x 512 לערוץ, 6.5 בגודל פיקסלים יקרומטר) הם לעתים קרובות מרחב נופה במהלך או לאחר הרכישה (איור 5c). עיבוד תמונה ניתן לבצע כדי ליצור הפעלה מפות רה-פולריזציה באמצעות אלגוריתמים מותאמים אישית23,33,43,45 (איור 3d), עם זמן ההפעלה של כל פיקסל בליבו הוגדר כנגזרת המקסימלית של הפוטנציאל של הפעולה או הסידן משיכה ארעית. איור 1: התקנה ניסויית. (א) דיאגרמה של מערכת היתוך לב מבודדת; חיצים מציין את כיוון הזרימה. (ב) לב קאננולה מוצג עם מיקום אלקטרודה. RA = ימין atria, RV = החדר הימני, LV = שמאל חדר החדר, א = להוביל השנייה בג. (ג) פלטפורמת ההדמיה בקרבת רקמת הלב. (ד) פליטה של כל בדיקה משלימה (מתח, סידן) מופרדים על ידי אורך הגל באמצעות תמונה פיצול המכשיר עם מסנני פליטה המתאים ומראה דיקרואיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: במשקל לב, קצב ומדידות זרימה. (א) משקל הלב ליחס משקל הגוף לכל חזרזיר המשמש במחקר (n = 18). (ב) קצב לב נמדד ~ 10 דקות אחרי דפיברילציה ושוב בסוף הלימודים (כ 1 h). (ג) זרימה כלילית יורדת באופן מופחת לאחר הפרזיה עם uncoupler מכני (+ bdm) עקב ביקוש החמצן מופחתת. סרגלי שינוי גודל מייצגים ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: דוגמאות מייצגות של הקלטות אלקטרוליג של השנייה שנאספו במהלך קצב סינוס או בתגובה לצעדים חיצוניים. (א) קצב סינוס רגיל. (ב) דוגמא להאפיארחוגה הצועדת באורך המחזור של 400 Ms (S1-s1), ששימש לניסויי דימות. (ג) למעלה: פרפור הצעדים כדי לזהות WBCL; לכידת מוצלח נצפתה ב S1 = 250 ms שבו פרפור הולכה חדרית הוא נצפתה. שים לב כי פרפור הצעדים יכול לשמש כדי לקבוע SNRT (זמן הפרשות הצומת הסינוס, לאחר התחלת הצעדים החיצוניים). בתחתית: כמו אורך מחזור S1 הוא ירד ל 205 ms, ההולכה לחדר נכשלת. (ד) למעלה: האפיארחיוג צועד (S1-S2) כדי לזהות את verp; לכידת מוצלח נצפתה ב S1 = 450 ms, S2 = 300 ms. למטה: כמו אורך מחזור S2 הוא ירד ל 250 ms, הרקמה החדרית נכשלת ללכוד. (ה) פרפור הצעדים (S1-S2) כדי לזהות את AVNERP. למעלה: לכידה מוצלחת נצפתה ב S1 = 450 ms, S2 = 200 ms. בתחתית: כמו אורך מחזור S2 הוא ירד ל 199 ms, הולכה אל החדר נכשלת. חיצים כחולים מציין דוקרנים, חיצים אדומים מציינות לכידה (‘ C ‘) או ללא לכידה (‘ NC ‘). S1-s1 = מצעדים דינמיים, S1-S2 + מניע מיותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: נתונים אופטיים במהלך קצב סינוס ופרוזדורים חדרית. משמאל: תמונות מייצגות של לב חזיר טעון צבע (Vm = מתח, RH237; Ca = סידן, Rhod2), מבט קדמי. Spatially מסוננים מתח ממברנה והסידן התאיים אותות פלורסנט מתוך לב חזיר במהלך קצב סינוס (מרכז). אותות מתח וסידן במהלך פרוזדורים המוח (מימין). גדלים של אזור האות (15 x 15 פיקסלים = 2.4 x 2.4 mm2, 30 x 30 = 4.8 x 4.8 mm2 גודל ליבה) מיוצגים כריבועים אדום וכחול. יחידות = ΔF/F. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: נתונים אופטיים מלנגדורף-לבבות חזיר ממקורות. לא מעובד, מסונן מרחב (A) במתחtransממברניתו (ב) הסידן התאיים אותות מתוך החדרים הימני והשמאלי במהלך התנועה החשמלית בפיסגה. בלתי מסונן, אותות ממוצעים מרחב מתארים פוטנציאל פעולה אופטי וארעיות סידן מאזורים של ריבית (יחידות האות הם ΔF/F). (ג) כיסוי של מעבר מנורמל מדגים פוטנציאל פעולה-זמן צימוד סידן זמני (המעבר הנמוך מסונן ב 75 Hz). (ד) מעבד אותות על פני משטח האפירחייג כדי להפיק מפות איזוכואליות של פרמטרים הזמני, כולל זמן ההפעלה (tact) ו 80% רה-פולריזציה זמן. (ה) הפיצויים הזמניים החשמליים והסידן עקומות שנוצרו בתדרים מרובים (משמאל) עם ניתוח סטטיסטי (מימין) כדי להמחיש זמן רה-פולריזציה ארוך יותר באורכים מחזור איטי. קנה מידה של סרגלים = ממוצע ± SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. כימי נוסחה משקל מולקולרי g/L נתרן כלוריד מיכל שלמה 58.44 5.26 נתרן גלוקונאט C6H11נאו7 218.14 5.02 נתרן אצטט ג2h3נאו2• 3h2O 136.08 3.68 אשלגן כלורי אשלגן כלורי 74.55 0.63 מגנזיום כלוריד מיכלהשני 95.21 0.1405 8.4% נתרן ביקרבונט נחקו3 84.01 13 ניטול ג6H14O6 182.17 16.3 מגנזיום גופרתי מיכל בע 120.37 4 pH 7.4 מודול (mOsmol/L) 294 שולחן 1: שינה את הקרדיו, מתכון של דל נידו.

Discussion

למרות מודלים מחקר לב וכלי דם נע בין הסלולר להכנות vivo, יש סחר הטבועה בין רלוונטיות קלינית ושירות ניסיוני. בספקטרום זה, הלב המבודד-לאנגדורף-מדבר נשאר פשרה מועילה לחקר הפיזיולוגיה של הלב48. מודל הלב כולו מייצג רמה גבוהה יותר של שילוב פונקציונלי ומבניים מאשר תא אחד או מונאולאיירס רקמה, אבל גם לנמנע את המורכבות הכוללת הקשורים במודלים vivo. יתרון מרכזי במהלך ניסויים כפול מיפוי אופטי הוא משטח האפיארחיוג של הלב המבודד ניתן לצפות, ו הדמיה פלואורסצנטית של פוטנציאל transממברנות הטיפול בסידן ניתן להשתמש כדי לפקח על פיזיולוגיה לב34.

דגמי מכרסמים הם הנפוצים ביותר עבור הכנות לב מבודדים לעומת בעלי חיים גדולים יותר, בשל חלק העלות המשויכת של למעלה-להגדיל את כל האלמנטים המעורבים (למשל, נפח הפתרון, מעגל זלוף, כמות של צבעים uncouplers מכני) יחד עם חוסר יציבות ונטייה גדולה יותר עבור הפרעות קצב בעלי חיים גדולים יותר10,36,49. אחד היתרונות לשימוש בלבבות חזיר הוא שהם דומים מאוד ללב האנושי במבנה, בגודל ובקצב של התכווצות, ולכן מודלים בדיוק יותר פרמטרים הומודינמיים כמו זרימת דם כלילית ופלט לב. כמו כן, לבני אדם ולחזירים יש טיפול דומה בסידן, מרווחי אלקטרוג37, ומורפולוגיה פוטנציאלית של פעולה, כולל הערוצים הבסיסיים שהוא מייצג12,50,51, 52. פרוטוקול זה מתאר בפרוטרוט את השלבים ליצירת דגם בעלי חיים גדול שאינו מיועד לאפיין באופן מקיף את פונקציית אוטם שריר הלב. הדמיה בו של מתח טרנסקרום (RH237) וסידן תאיים (Rhod2), בשימוש יחד עם פרוטוקולים אלקטרולוגיים הוקמה, מספק את ההזדמנות כדי לאתר מנגנונים האחראים לב שונה פונקציה. ניתן להשתמש במתודולוגיה המתוארת לבדיקת בטיחות טרום-קלינית, הקרנת טוקסילוגיה וחקירת מחלות גנטיות או אחרות. יתר על כן, המתודולוגיה המתוארת ניתן לשנות ומותאם לשימוש עם מודלים לב אחרים (למשל, כלב, בן אדם) בהתאם למוקד מחקר ספציפי53,54,55.

ישנם כמה שינויים קריטיים כדי לזכור כאשר מעבר ממודל מכרסם קטן יותר מודל חזיר גדול עבור מבודדים, ההכנות לבבות שלמים. במהלך ההכנה וההתקנה, מומלץ להוסיף אלבומין כדי לשמור על לחץ אונטיק ולהפחית בצקת (פלוס אנטיקצף, במידת הצורך)56,57,58,59. יתר על כן, מבשם המכיל אלבומין יכול גם לסייע במחקרים מטבולית הדורשים גם חומצות שומן תוספת לתקשורת60,61. בניגוד לבבות מכרסם, הלב חזיר גדול יותר לא צריך להיות מתחת למים במדיה חמה בשל משטח קטן יותר ליחס נפח ואת נפח מוגבר של מדיה החמים זורם דרך כלי כלילית אשר שומר טוב יותר את הטמפרטורה. כפי שצוין קודם לכן, הצבתי בדיקת טמפרטורה בתוך החדר הימני ועל המשטח האפילאני של החדרים הימניים והשמאליים, והתבונן רק בתנודות קלות בטמפרטורה של 1-2 ° c בכל שלושת המיקומים במהלך המחקר. חשוב מכך, שיעורי זרימה מהירים כאלה יכולים גם להגביר את הסבירות של בועות ותסחיף פוטנציאלי. כדי לעקוף בעיה זו, אנו ממליצים להשתמש במלכודת בועה עם אבובים משעמם גדול המוביל ישירות לתוך צינורית אבי העורקים. באופן דומה, מצאנו את זה שימושי ביותר שיש שני אנשים שעובדים במקביל לצינורית העורקים על לב גדול יותר (וכבדה יותר); אדם אחד להחזיק את העורקים פתוח עם הומוסטטיסטיקה חסון ואחר כדי לאבטח את העורקים לקאנולה באמצעות נייר הטבור. במתודולוגיה המתוארת, גילינו כי הפרזיה עם הקרדיולוגית והדפיברילציה היו חיוניים להתאוששות לב, שהיא בניגוד להכנות לפעימות לב מכרסמים. בניסיון שלנו, רק כמה לבבות שגורשו חזרו לפעילות רגילה שמונעת בסינוס ללא משיכת דם.

כדי לשפר את נקודות הקצה של הדמיה אופטית, הכנת לב תלוי מגבילה את השפעת הבוהק שיכול להתרחש עם לב תת-שקוע. כמו-כן, גם הלב התלוי מונע כל דחיסה או פשרה של כלי הדם הכליליים בהיבט האחורי של הלב, העלול להתרחש בעת הנחת הלב למטה באופן אופקי להדמיה אנכית. מצאנו גם כי טעינת צבעי פלורסנט לאחר מלכודת הבועה (קרוב צינורית אבי העורקים) משופר מאוד מכתים רקמות ואותות אופטיים. בסופו של דבר, כדי לשפר את נקודות הקצה של הפיזיולוגיה לב, השימוש באלקטרודה גדולה יותר של גירוי קואקסיאלי מונחה פרפור מוצלח. למרות שאנו מתארים את השימוש אינהלטורים לזהות לכידת ואובדן של לכידה עבור פרמטרי EP שונים, קטטרים תאיים או אלקטרודות הקלטה דו-קוטבית יכול לשמש גם.

המחקר שלנו היה ממוקד בפיתוח מתודולוגיה עבור מיפוי אופטי כפול והערכה אלקטרופיסיולוגית במודל לב חזירי מבודד, שלם. בשל הדמיון עם לב האדם לנוער, הלב חזירי נשאר מודל פופולרי עבור מחקרים התמקדו קרדיולוגיה ילדים או פגמים בלב מולדים. וחשוב מכך, הגישה המתוארת יכולה להיות מותאמת לשימוש עם לבבות גדולים בוגרים ו/או מינים שונים של ריבית. ואכן, מעבדות אחרות עשויות לגלות שהשימוש בלבבות כלבים או לבבות אנושיים (או תורם או חולה) הינם ישימים יותר עבור ההתמקדות הספציפית שלהם במחקר53,54,55. עוד מגבלה פוטנציאלית למחקר זה הוא השימוש בלתי מצמד מכני כדי להפחית את התנועה במהלך ההדמיה. בלייבסטטין הפך הבלתי מצמד של הבחירה ביישומים הדמיה לב בשל ההשפעות המינימליות שלה על פרמטרים של אק, הפעלה ו עקשן תקופות41,62,63. BDM היא בחירה פחות יקרה, אשר יכול להיות חשוב במיוחד במחקרים בעלי חיים גדולים הדורשים כמויות גדולות יותר של מכונה ומצמד מכני, אבל זה ידוע שיש לו השפעה רבה יותר על האשלגן והסידן זרמים שיכולים לשנות את פוטנציאל הפעולה מורפולוגיה64,65,66,67. אם נעשה שימוש ב-BDM, שים לב שקיצור APD מגדיל את הפגיעות של הלבבות המושרה על ידי הפרעות בזעזועים68. לעומת זאת, המגבלה העיקרית לשימוש ble, בלוסטטין הוא הרגישות שלה פוטורעילות, למרות ניסוחים חלופיים כי יש מופחת אפקטים אלה69,70,71. לבסוף, המתודולוגיה המתוארת משתמשת מערכת מצלמה אחת עבור ניסויים כפול מיפוי אופטי, אבל חשוב לציין כי מחקרים מחקר התמקדו פרפור פרוזדורים ו/או מעקב אחר גלי החשמל על פני משטח האפיארלחייג יהיה צורך לשנות גישה זו כדי לכלול דימות פנורמי תלת מימדי, כפי שמתואר על ידי אחרים15,19,72,73,74,75 .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מכירים בהכרת תודה ד ר מת קיי לקבלת הדרכה ניסויית מועילה, ומאנג רמדאן ומוהיימר צ’דהורני לסיוע טכני. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01HL139472 כדי NGP, R01 HL139712 ל NI), המכון לחקר הילדים, מכון הלב הלאומי לילדים ושייח ‘ זאייד מכון לחדשנות כירורגית ילדים.

Materials

(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560-5MG Mechanical Uncoupler
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753-100G Mechanical Uncoupler
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418
Analog signal interface emka Technologies itf16USB
Antifoam Sigma-Aldrich A5758-250ML
Antifoam Y-30 Emulsion Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A5758
Aortic cannula, 5/16” Cole-Parmer 45509-60
Bubble trap Sigma-Aldrich CLS430641U-100EA
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
Camera, sCMOS Andor Technology Zyla 4.2 PLUS
Coaxial stimulation electrode (atria) Harvard Apparatus 73-0219
Defibrillator Zoll M Series
Dichroic mirror Chroma Technology T660lpxrxt-UF2
Differential amplifier Warner Instruments DP-304A
Emission filter, calcium Chroma Technology ET585/40m
Emission filter, voltage Chroma Technology ET710lp
EP stimulator (Bloom) Fisher Medical DTU-215B
Excitation filter Chroma Technology CT510/60bp
Excitation lights Thorlabs SOLIS-525C
Filter McMaster-Carr 8147K52
Filter cartridge, polypropylene Pentair PD-5-934
Filter housing McMaster-Carr 9979T21
Flow transducer Transonic ME6PXN
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968
Heating coil Radnoti 158821
Hemofilter Hemocor HPH 400
Hemostatic Forceps World Precision Instruments 501326
Image Splitter Cairn Research OptoSplit II
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Large-bore tubing, I.D. 3/8” Fisher Scientific 14-169-7H
Lens 50 mm, 0.95 f-stop Navitar DO-5095
Metamorph Molecular Devices Image Alignment
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
Mucasol detergent Sigma-Aldrich Z637181-2L
Na Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm AD Instruments Inc. MLA1204
Noise eliminator Quest Scientific Humbug
Perfusion pump PolyStan A/S 1481
Pressure transducer World Precision Instruments BLPR2
Reservoir, 2 liter Cole-Parmer UX-34541-07
RH237 AAT Bioquest Inc. 21480
Rhod2-AM AAT Bioquest Inc. 21062
Stimulation electrode (ventricle) Harvard Apparatus 73-0160
Surgical Suture McKesson Medical-Surgical 890186
Transducer amplifier World Precision Instruments TBM4M
Tubing flow console Transonic TS410
Umbilical tape Jorvet J0025UA
Water bath/circulator VWR 89400-970
Surgical Tools
Bandage shears Harvard Apparatus 72-8448 Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm
Electrocautery Dalwha Corp. Ltd. BA2ALD001 Model: 200 Basic
Hemostat Roboz RS-7476 St Vincent Tube Occluding Forceps
Hemostatic forceps Harvard Apparatus 72-8960 Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm
Hemostats Harvard Apparatus 72-8985 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm
Mayo scissors WPI 501749 14.5 cm, Straight
Metzenbaum scissors WPI 501747 11.5 cm, Straight
Mosquito forceps Harvard Apparatus 72-8980 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm
Needle holder Harvard Apparatus 72-8828 Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length
Pediatric cross clamp Roboz RS-7660 Cooley-Derra Clamp 6.25" 5mm Calibrations
Right angle forceps WPI 501240 Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle
Scalpel Ted Pella 549-4 Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades
scissors Harvard Apparatus 72-8380 Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm
Straight Serrated forceps WPI 500363 Dressing Forceps 15.5cm
Towel clamp WPI 501700 Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS
Weitlaner retractor WPI 501314 Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2×3 Sharp Prongs
Disposables
3-0 prolene suture Various vendors Various vendors
Vessel loop Aspen surgical 011001PBX Sterion® Vessel Loop, 0.8 x 406mm
Cardioplegia (Plegisol) Pfizer 00409-7969-05 Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg
Heparin Various vendors Various vendors 300 U/kg
Syringe and Needle Various vendors Various vendors 60mL & 18G respectively
Umbilical tape Ethicon U12T
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. Journal of Visualized Experiments. (103), e53166 (2015).
  2. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2012).
  3. Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. Journal of Visualized Experiments. (65), e4115 (2012).
  4. Capecchi, M. R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends in genetic. 5 (3), 70-76 (1989).
  5. Hall, B., Limaye, A., Kulkarni, A. B. Overview: generation of gene knockout mice. Current Protocols in Cell Biology. , 1-17 (2009).
  6. Schechter, M. A., et al. An Isolated Working Heart System for Large Animal Models. Journal of Visualized Experiments. (88), e51671 (2014).
  7. Arlock, P., et al. Ion currents of cardiomyocytes in different regions of the Göttingen minipig heart. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 86, 12-18 (2017).
  8. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of anatomy. 193, 105-119 (1998).
  9. Markert, M., et al. Validation of the normal, freely moving Göttingen minipig for pharmacological safety testing. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 60 (1), 79-87 (2009).
  10. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  11. Bertho, E., Gagnon, G. A comparative study in three dimension of the blood supply of the normal interventricular septum in human, canine, bovine, porcine, ovine and equine heart. Diseases of the Chest. 46, 251-262 (1964).
  12. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (5), 432-438 (2014).
  13. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (4), 30 (2016).
  14. Jordan, C. P., et al. Minimally Invasive Resynchronization Pacemaker: A Pediatric Animal Model. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (6), 2210-2213 (2013).
  15. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophysical Journal. 92 (3), 1090-1095 (2007).
  16. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden Saugethierherzen [Investigations on the surviving mammalian heart]. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1895).
  17. Pumir, A., Arutunyan, A., Krinsky, V., Sarvazyan, N. Genesis of ectopic waves: role of coupling, automaticity, and heterogeneity. Biophysical Journal. 89 (4), 2332-2349 (2005).
  18. Kay, M. W., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Rogers, J. M. Lifetimes of epicardial rotors in panoramic optical maps of fibrillating swine ventricles. American journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 291 (4), 1935-1941 (2006).
  19. Lee, P., et al. Low-Cost Optical Mapping Systems for Panoramic Imaging of Complex Arrhythmias and Drug-Action in Translational Heart Models. Scientific Reports. 7, 43217 (2017).
  20. Venkataraman, R., Holcomb, M. R., Harder, R., Knollmann, B. C., Baudenbacher, F. Ratiometric imaging of calcium during ischemia-reperfusion injury in isolated mouse hearts using Fura-2. BioMedical Engineering OnLine. 11 (1), 39 (2012).
  21. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 95 (1), 21-33 (2004).
  22. Zimmermann, W. H., et al. Three-dimensional engineered heart tissue from neonatal rat cardiac myocytes. Biotechnology and Bioengineering. 68 (1), 106-114 (2000).
  23. Jaimes, R., et al. A Technical Review of Optical Mapping of Intracellular Calcium within Myocardial Tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (11), 1388-1401 (2016).
  24. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  25. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging Calcium Sparks in Cardiac Myocytes. Methods in Molecular Biology. 689, 205 (2011).
  26. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
  27. Thomas, K., Goudy, J., Henley, T., Bressan, M. Optical Electrophysiology in the Developing Heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (2), 28 (2018).
  28. Nikolski, V., Efimov, I. Fluorescent imaging of a dual-pathway atrioventricular-nodal conduction system. Circulation Research. 88 (3), 23-30 (2001).
  29. Posnack, N. G., et al. Bisphenol A Exposure and Cardiac Electrical Conduction in Excised Rat Hearts. Environmental Health Perspectives. 122 (4), 384-390 (2014).
  30. Garrott, K., et al. KATP channel inhibition blunts electromechanical decline during hypoxia in left ventricular working rabbit hearts. The Journal of Physiology. 595 (12), 3799-3813 (2017).
  31. Wang, Z., et al. Exposure to Secondhand Smoke and Arrhythmogenic Cardiac Alternans in a Mouse Model. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127001 (2018).
  32. Francis Stuart, S. D., et al. Age-related changes in cardiac electrophysiology and calcium handling in response to sympathetic nerve stimulation. The Journal of Physiology. 596 (17), 3977-3991 (2018).
  33. Jaimes, R., et al. Plasticizer Interaction With the Heart: Chemicals Used in Plastic Medical Devices Can Interfere With Cardiac Electrophysiology. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (7), (2019).
  34. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
  35. Li, N., Wehrens, X. H. Programmed Electrical Stimulation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
  36. Dor-Haim, H., Berenfeld, O., Horowitz, M., Lotan, C., Swissa, M. Reduced Ventricular Arrhythmogeneity and Increased Electrical Complexity in Normal Exercised Rats. PLoS ONE. 8 (6), 66658 (2013).
  37. Noszczyk-Nowak, A., et al. Normal Values for Heart Electrophysiology Parameters of Healthy Swine Determined on Electrophysiology Study. Advances in Clinical and Experimental. 25 (6), 1249-1254 (2016).
  38. Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. NADH changes during hypoxia, ischemia, and increased work differ between isolated heart preparations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (4), 529-537 (2014).
  39. Schramm, M., Klieber, H. G., Daut, J. The energy expenditure of actomyosin-ATPase, Ca(2+)-ATPase and Na+,K(+)-ATPase in guinea-pig cardiac ventricular muscle. The Journal of Physiology. 481, 647-662 (1994).
  40. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  41. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
  42. Evertson, D. W., et al. High-Resolution High-Speed Panoramic Cardiac Imaging System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1241-1243 (2008).
  43. Jaimes, R., et al. Path Splitter: A New Approach for Truly Simultaneous Dual Optical Mapping of the Heart with a Single Camera. bioRxiv. , 651380 (2019).
  44. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  45. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (7), 753-765 (2012).
  46. O’Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
  47. Mironov, S. F., Vetter, F. J., Pertsov, A. M. Fluorescence imaging of cardiac propagation: spectral properties and filtering of optical action potentials. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (1), 327-335 (2006).
  48. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
  49. Nishida, K., Michael, G., Dobrev, D., Nattel, S. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities. Europace. 12 (2), 160-172 (2010).
  50. Verdouw, P. D., Van Den Doel, M. A., De Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
  51. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (4), 30 (2016).
  52. Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as Models in Biomedical Research and Toxicology Testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  53. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical Volume of Human Myocardium Necessary to Maintain Ventricular Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), 006692 (2018).
  54. Hill, A. J., et al. In Vitro Studies of Human Hearts. The Annals of Thoracic Surgery. 79 (1), 168-177 (2005).
  55. Fedorov, V. V., et al. Structural and functional evidence for discrete exit pathways that connect the canine sinoatrial node and atria. Circulation Research. 104 (7), 915-923 (2009).
  56. Jacob, M., et al. Albumin Augmentation Improves Condition of Guinea Pig Hearts After 4 hr of Cold Ischemia. Transplantation. 87 (7), 956-965 (2009).
  57. Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 254 (6), 1105-1112 (1988).
  58. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  59. Werner, J. C., Whitman, V., Fripp, R. R., Schuler, H. G., Morgan, H. E. Carbohydrate metabolism in isolated, working newborn pig heart. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 241 (5), 364-371 (1981).
  60. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
  61. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 13 (1), 168-172 (1989).
  62. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), 262-269 (2012).
  63. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (5), 503-512 (2012).
  64. Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
  65. Liu, Y., et al. Effects of diacetyl monoxime on the electrical properties of sheep and guinea pig ventricular muscle. Cardiovascular Research. 27 (11), 1991-1997 (1993).
  66. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (45), 419-424 (2010).
  67. Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74 (6), 305-313 (1994).
  68. Cheng, Y., Li, L., Nikolski, V., Wallick, D. W., Efimov, I. R. Shock-induced arrhythmogenesis is enhanced by 2,3-butanedione monoxime compared with cytochalasin D. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 310-318 (2004).
  69. Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochemical and Biophysical Research Communications. 320 (3), 1020-1025 (2004).
  70. Sakamoto, T., Limouze, J., Combs, C. A., Straight, A. F., Sellers, J. R. Blebbistatin, a myosin II inhibitor, is photoinactivated by blue light. Biochemistry. 44 (2), 584-588 (2005).
  71. Várkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6 (1), 26141 (2016).
  72. Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 47 (10), 1382-1391 (2000).
  73. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. Journal of Biomedical Optics. 12 (4), 44019 (2007).
  74. Gloschat, C., et al. RHYTHM: An Open Source Imaging Toolkit for Cardiac Panoramic Optical Mapping. Scientific Reports. 8 (1), 2921 (2018).
  75. Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 51 (7), 1219-1229 (2004).

Tags

OptocardiographyElectrophysiologyLangendorff-perfused HeartsCardiovascular MalfunctionDisease ModelingPharmacologyToxicologyGlass SizersCardiac ElectrophysiologyImagingPerfusion SystemCardioplegiaKrebs-Henseleit MediumDefibrillationCardioversion

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Swift, L. M., Jaimes III, R., McCullough, D., Burke, M., Reilly, M., Maeda, T., Zhang, H., Ishibashi, N., Rogers, J. M., Posnack, N. G. Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts. J. Vis. Exp. (153), e60472, doi:10.3791/60472 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image