緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量
Summary
ここで、緑膿菌の小コロニー変異体を培養する成長条件について説明する。また、従来のウロン酸カルバゾールアッセイとアルギン酸特異的モノクローナル抗体(mAb)ベースのELISAを用いて、P.アルギノーサが産生するエキソ多糖アルギン酸塩の検出と定量の2つの方法についても説明する。
Abstract
日和見グラム陰性細菌病原体である緑膿菌は、無菌性アルギン酸を過剰産生し、粘性イチと呼ばれる独特の表現型を生じさせる。アルギン酸は、嚢胞性線維症(CF)患者の予後不良をもたらす慢性肺感染症に関連している。アルギン酸の産生を調節する経路を理解することは、アルギン酸形成を標的とする新しい治療戦略の開発に役立つ可能性がある。もう1つの疾患関連表現型は小コロニー変異体(SCV)である。SCVは、細菌の増殖が遅いため、しばしば抗菌薬に対する耐性の増加に関連しています。本論文では、まずピリミジン生合成変異による遺伝子的に定義された形態のP.エルギノーザSCVを培養する方法を示す。窒素塩基、ウラシルまたはシトシンの補充は、これらの突然変異体に正常な成長を戻し、環境から遊離塩基を清掃するサルベージ経路の存在を実証する。次に、細菌性アルギン酸の測定方法を2つ検討する。第1の方法は、そのウロン酸モノマーに多糖類の加水分解に依存し、続いて発色試薬、カルバゾールによる誘導体化を行い、第2の方法は市販のアルギン酸特異的mAbに基づくELISAを使用する。どちらの方法でも、定量に標準曲線が必要です。また、免疫学的方法はアルギン酸定量に特異的であり、臨床検体におけるアルギン酸塩の測定に使用することができることも示した。
Introduction
緑膿菌による慢性肺感染症は、嚢胞性線維症(CF)患者における罹患率および死亡率の主な原因である。幼児期には、患者はP.エルギノーサ1、2の非粘性分離株を含む複数の細菌病原体によって植民地化される。小コロニー変異体(SCV)分離株の出現は、ムコイド分離株と同様に、慢性感染症への発症のマーカーである。SCV分離株は、その遅い成長率4のために非常に薬剤耐性3であり、P.アルギノーサによる治療連隊および他の慢性感染症5で重度の抑止力を与える。Al Ahmar et al.6の研究は、デノボピリミジン生合成によって連結されたSCVとムコイドとの間のリンクを示した。ピリミジン飢餓は、ピリミジン産生に関与する遺伝子の変異に起因して、非粘性体参照株PAO1および粘液誘導体PAO581(PAO1mucA25)におけるSCV表現型をもたらした。
CFにおける慢性肺感染症の重要な疾患マーカーであるアルギン酸過剰産生が重要な疾患マーカーであるにもかかわらず、アルギン酸の量と肺病理との間に直接的な相関関係があるかどうかは明らかではなく、また、アルギン酸塩を治療7の予後マーカーとして用いることができるかどうかは不明である。アルギン酸産生は主に2つのオペロンによって調節され、調節性オペロン(algUmucABCD)8、9および生合成オペロン(algDオペロン)10、11。アルギン酸産生は、シグマ因子AlgU9、12(別名AlgT)および抗シグマ因子MucA13の分解によって厳しく調節される。患者の痰標本からのその中のアルギン酸塩の産生を監視する能力は、新しい治療オプションの開発に役立つ可能性があります。
ここで、ピリミジン・デ・ノボを合成できない変異体によって引き起こされるSCVの存在を検出する増殖条件を説明する。ウラシルおよび/またはシトシンの補充は、ピリミジンヌクレオチドの窒素塩基を、培地に対して、サルベージ経路を活性化し、したがって突然変異体における正常な増殖を回復させる。この特定のSCV変異体の増殖方法は、患者試料中のピリミジン変異を同定するスクリーニング方法として用いることができる。また、P. eeruginosaによって生成され分泌されるアルギン酸塩の検出と測定の2つの方法について議論する。最初は、高濃度の酸を用いて多糖類を分解し、次いで、サンプル中の濃度を定量するために測色指標を加える従来の方法14、15、16である。2つ目の方法は、当社の研究室で開発された、QEDバイオサイエンスが開発した抗アルギン酸モノクローナル抗体(mAb)を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を利用しています。ELISA法は、ウロン酸アッセイよりも特異的で感度が高く、高濃度硫酸の回避により、より安全な使用を可能にします。ELISAの能力を、患者痰サンプルに直接使用してアルギン酸を測定し、感染の異なる期間に肺に存在するアルギネートの量に従うモニタリング診断ツールとして開発することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
SCVおよびアルギン酸は、いずれもいくつかの慢性感染症に関与する重要な疾患マーカーである。したがって、SCVを成長させる能力だけでなく、P.エルギノーサによるアルギネートの調節と生産を研究することは、これらの慢性疾患に対する新しい治療法の発見に不可欠です。
SCV株は、その他のP.エルギノーサ株と比較して成長速度4が遅いた…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(NIH)助成金R44GM113545とP20GM103434によってサポートされました。
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
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