Cultura della piccola colonia Variante di Pseudomonas aeruginosa e Quantitazione del suo Alginato

Le infezioni polmonari croniche con Pseudomonas aeruginosa sono una delle principali cause di morbilità e mortalità nei pazienti con fibrosi cistica (CF). Durante la prima infanzia, i pazienti sono colonizzati da più patogeni batterici tra cui isolati non mucoidi di P. aeruginosa^1,2. L’emergere della variante della piccola colonia (SCV) isola così come gli isolati mucoidi è un marcatore per l’insorgenza delle infezioni croniche. Gli isolati di SCV sono altamente resistenti ai farmaci³ a causa dei loro lenti tassi di crescita⁴, il che li rende un grave deterrente nei reggimenti di trattamento e altre infezioni croniche⁵ da P. aeruginosa. Il lavoro di Al Ahmar et al.⁶ ha mostrato un legame tra SCV e mucoidy collegato dalla biosintesi della pirimofina de novo. La fame di pirimidine, a causa di mutazioni nei geni coinvolti nella produzione di pirimidine, ha portato al fenotipo SCV nel ceppo di riferimento non mucoide PAO1 e alla derivata mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).

Anche se la sovrapproduzione algerata è un importante marcatore di malattia per le infezioni polmonari croniche nella CF, non è chiaro se esista una correlazione diretta tra la quantità di patologia alginata e polmonare, e non è chiaro se l’alginato possa essere utilizzato come marcatore di prognosi per il trattamento⁷. La produzione di alginati è regolata principalmente da due operoni, un operone normativo (algUmucABCD)^8,9 e l’operone biosintetico ( operonealgD) ^10,11. La produzione di algerino è strettamente regolata dal fattore sigma AlgU^9,12 (noto anche come AlgT) e dalla degradazione del fattore anti-sigma MucA¹³. La capacità di monitorare la produzione di algerino in situ dai campioni di espettorato dei pazienti può aiutare nello sviluppo di nuove opzioni terapeutiche.

Qui, descriviamo una condizione di crescita che rileva la presenza di SCV causata da mutanti che non possono sintetizzare la pirimidine de novo. Il completamento dell’uracile e/o della citosina, la base azotata del nucleotide pirimidine, a medio attiva il percorso di recupero, ripristinando così la normale crescita nei mutanti. Questo metodo di crescita per questi specifici mutanti SCV può essere utilizzato come metodo di screening per identificare le mutazioni della pirimofina nei campioni di pazienti. Inoltre, discutiamo due metodi per il rilevamento e la misurazione di alginato prodotto e secreto da P. aeruginosa. Il primo è il metodo tradizionale^14,15,16 di degradare il polisaccaluro utilizzando un’alta concentrazione di acido e quindi l’aggiunta di un indicatore colorimetrico per quantificare la concentrazione nel campione. Il secondo metodo, sviluppato nel nostro laboratorio, utilizza l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) utilizzando un anticorpo monoclonale anti-alginato (mAb) sviluppato da QED Biosciences. Il metodo ELISA si dimostra più specifico e sensibile rispetto all’acido uronico e consente un uso più sicuro a causa dell’evitamento dell’acido solforico altamente concentrato. Con la capacità dell’ELISA di essere utilizzato direttamente su campioni di espettorato del paziente per misurare l’alginato, può essere sviluppato come strumento diagnostico di monitoraggio per seguire la quantità di alginato presente nei polmoni in diversi periodi dell’infezione.