ثقافة البديل مستعمرة صغيرة من Pseudomonas aeruginosa وكمية من Alginate لها
Summary
هنا ، ونحن نصف شرط النمو لثقافة البديل مستعمرة صغيرة من Pseudomonas aeruginosa. كما وصفنا طريقتين منفصلتين للكشف عن الجينات الثيوبولية الهاريادية المنتَجة التي تنتجها P. aeruginosa وكمية الجينات التي تنتجها P. aeruginosa باستخدام مقادير حمض البوليازول التقليدي ة وجسم مضاد أحادي النسيلة (mAb) قائم على ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa، وهو عامل ممرض البكتيرية سلبية الغرام الانتهازية ، يمكن أن تنتج الإفراط في الجينات exopolysaccharide مما أدى إلى نمط ظاهري فريد يسمى المخاطية. يرتبط Alginate بالتهابات الرئة المزمنة مما يؤدي إلى سوء التكهن في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF). يمكن أن يساعد فهم المسارات التي تنظم إنتاج الجينات في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة تستهدف تكوين الجينات. نمط ظاهري آخر مرتبط بالمرض هو متغير المستعمرة الصغيرة (SCV). SCV يرجع ذلك إلى بطء نمو البكتيريا وغالبا ما يرتبط مع زيادة المقاومة لمضادات الميكروبات. في هذه الورقة، نظهر أولا طريقة لزراعة شكل محدد وراثيا من P. aeruginosa SCV بسبب الطفرات البيريميدين الحيوي. مكملات من القواعد النيتروجينية، أوراسيل أو السيتوزين، يعيد النمو الطبيعي لهذه المسوخ، مما يدل على وجود مسار الإنقاذ الذي يمسح القواعد الحرة من البيئة. بعد ذلك ، نناقش طريقتين لقياس الجينات البكتيري. وتعتمد الطريقة الأولى على التحلل المائي للسكاريد المتعدد السكاريد إلى مونومر حمض البولينيك متبوعاً بالاشتقاق باستخدام كاشف لوني، وهو الركلازول، في حين تستخدم الطريقة الثانية مادة ELISA على أساس mAb المتاحة تجارياً والمحددة بالجينات. تتطلب كلتا الطريقتين منحنى قياسي للكمية. كما نُظهر أن الطريقة المناعية محددة للقياس الكمي للجينات ويمكن استخدامها لقياس الجينات في العينات السريرية.
Introduction
التهابات الرئة المزمنة مع Pseudomonas aeruginosa هي سبب رئيسي للمراضة والوفيات في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF). خلال مرحلة الطفولة المبكرة ، يتم استعمار المرضى من قبل مسببات الأمراض البكتيرية المتعددة بما في ذلك عزل nonmucoid P. aeruginosa1،2. ظهور البديل مستعمرة صغيرة (SCV) يعزل وكذلك عزل المخاطية هو علامة لبداية للالتهابات المزمنة. عزلات SCV هي مقاومة للأدوية عالية3 بسبب معدلات نموها البطيء4، مما يجعلها رادعا شديدا في أفواج العلاج وغيرها من الالتهابات المزمنة5 من قبل P. aeruginosa. وأظهر العمل الذي قام به الأحمر وآخرون6 وجود صلة بين SCV والفيويدي الذي يربطه التمثيل الحيوي دي نوفو بيريميدين. البيريميدين المجاعة، بسبب الطفرات في الجينات المشاركة في إنتاج البيريميدين، أدى إلى النمط الظاهري SCV في سلالة المرجع nonmucoid PAO1 ومشتق مخاطي، PAO581 (PAO1mucA25).
على الرغم من أن الإفراط في إنتاج الجينات هو علامة مرض مهمة لالتهابات الرئة المزمنة في CF ، إلا أنه ليس من الواضح ما إذا كان هناك ارتباط مباشر بين كمية الجينات وأمراض الرئة ، ومن غير الواضح ما إذا كان يمكن استخدام الجينات كعلامة تشخيص للعلاج7. وينظم أساسا إنتاج الجينات من قبل اثنين من operons، وoperon التنظيمية(algumucABCD)8،9 وoperon الاصطناعية الحيوية(algD operon)10،11. وينظم بإحكام إنتاج الجينات من قبل عامل سيغما AlgU9،12 (المعروف أيضا باسم AlgT) وتدهور عامل مكافحة سيغما MucA13. القدرة على رصد إنتاج الجينات في الموقع من عينات البلغم المرضى يمكن أن تساعد في تطوير خيارات علاجية جديدة.
هنا، ونحن نصف حالة النمو الذي يكشف عن وجود SCV الناجمة عن المسوخ التي لا يمكن توليف البيريميدين دي نوفو. مكملات الأوراسيل و / أو السيتوزين ، قاعدة النيتروجين من النيوكليوتيد البيريميدين ، إلى المتوسط ينشط مسار الإنقاذ ، وبالتالي استعادة النمو الطبيعي في المسوخ. ويمكن استخدام طريقة النمو هذه لمسوخ SCV محددة هذه كوسيلة فحص لتحديد الطفرات البيريميدين في عينات المرضى. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش طريقتين للكشف عن وقياس الجينات التي تنتجها ويفرزها P. aeruginosa. الأول هو الطريقة التقليدية14،15،16 من تحلل السكريات باستخدام تركيز عال من الحمض ثم إضافة مؤشر قياس الألوان إلى كمية التركيز في العينة. الطريقة الثانية، التي تم تطويرها في مختبرنا، تستخدم الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة (mAb) تم تطويره بواسطة QED Biosciences. تثبت طريقة ELISA أنها أكثر تحديدًا وحساسية من مُقازحمض البوليتيك وتسمح باستخدام أكثر أمانًا بسبب تجنب حمض الكبريتيك عالي التركيز. مع قدرة ELISA لاستخدامها مباشرة على عينات البلغم المريض لقياس الجينات، يمكن تطويره كأداة تشخيصية رصد لمتابعة كمية الجينات الموجودة في الرئتين في فترات مختلفة من العدوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
كل من SCV وalginate هي علامات المرض الهامة المتورطة في العديد من الالتهابات المزمنة. ولذلك، فإن القدرة على زراعة SCV وكذلك دراسة تنظيم وإنتاج الجينات من قبل P. aeruginosa هو جزء لا يتجزأ من اكتشاف علاجات جديدة لهذه الأمراض المزمنة.
سلالات SCV من الصعب المعروف أن تنمو بسبب معدل نموها ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) المنح R44GM113545 وP20GM103434.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
