Обнаружение бактерий, резидентов тканей в биопсии мочевого пузыря 16S rRNA Флуоресценция В ситу гибридизации

Протокол исследования был одобрен и следовал руководящим принципам Институциональных комитетов по биобезопасности и химической безопасности UT Dallas и UT Southwestern Medical Center. Использование биопсии от человека в этом протоколе был одобрен и следовал руководящим принципам институционального обзора советов UT Даллас и UT Southwestern Medical Center. Все лица, занимающиеся сбором и обработкой биопсии, имеют текущую защиту человека (HSP) и hipPA. 1. Ткань Подготовка к фиксации и параффин встраивания ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия была взята из согласия женщин, проходящих цистоскопию с электро-фулгуляции тригонита для передового управления рецидивирующей инфекции мочевыводящих путей (UTI). UTI определяется как 3 ИТУ в 12-месячный период. Сбор биопсии проводился в операционной, пока пациент находился под наркозом после получения информированного согласия пациента по протоколу UTSW IRB STU 082010-016. Все образцы были закодированы и деидентифицированы до экспериментов. Получить холодную чашку (1 мм3) биопсии из мочевого пузыря trigone с урологическими щипцы через гибкий цистоскоп и место сразу в стерильные 2 мл криовиальной содержащие 1,5 мл 4% V / V параформдегида (PFA), подготовленный в 1x стерильных фосфатных солей (PBS).ПРИМЕЧАНИЕ: 4% PFA в 1x PBS может быть сделано заранее и храниться при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока это необходимо. Исправьте биопсию на 6 ч при комнатной температуре или на 16-24 ч при температуре 4 градусов по Цельсию.ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность фиксации должна быть рассчитана на основе размера образца ткани и чрезмерной фиксации следует избегать. Не рекомендуется использовать глютаральдегид в качестве фиксатора, поскольку он вводит автофлюоресценции. В стерилизованном капоте или шкафе биобезопасности, удалить фиксатор путем pipetting и заменить 1,5 мл стерильных 1x PBS. Держите образцы на 4 кВ ночь или сразу же выполнять обработки тканей и парафин встраивания19. Используйте стерилизованный микротом для секции тканей блоков на 5 мкм толщины и придерживаться парафин ткани разделов заряженных стеклянный микроскоп слайды. Минимум два слайда на биопсию потребуется для протокола 16S rRNA FISH.ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань биопсии должна быть поперечно расположена по отношению к плоскости резки, чтобы обеспечить визуализацию уротелиальных слоев во всех секциях. Следует также отметить, что толщина секций должна быть оптимизирована для обнаружения бактериального сообщества. Более тонкие секции или выборка нескольких серийных секций могут потребоваться в случае инфекций, когда бактерии, проживающие в тканях, крайне скудны (например, бактерия, проживающая в тканях на 1000 клеток млекопитающих). 2. Флуоресценция В ситу Гибридизация с универсальными 16S rRNA зондов ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется два слайда на биопсию. Один слайд необходим для универсального зонда 16S rRNA и один слайд для управляющего зонда с скремблированным последовательность. Это важно для различения истинного сигнала от фонового сигнала во время микроскопии, так как эпителий мочевого пузыря является автоматически флуоресцентным в нескольких каналах. В дополнение к карабкаться зонд, блокирование с 0,1% Судан Черный B до монтажа может уменьшить фон аутофлуоресценции присущие ткани20. Приготовление реагентов и дымового капота Очистите пустой дым капот (или надлежащим образом оборудованы биобезопасности шкаф) с 70% этанола. Подготовьте буфер гибридизации, состоящий из 0,9 м хлорида натрия (NaCl), 20 мм Tris-HCl (pH 7.2), 0,1% сульфата натрия (SDS) в 10 мл стерильной фильтрованной воды.ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная фильтрованная вода может быть подготовлена путем прохождения автоматической дистиллированной воды через фильтр 0,22 мкм. Буфер гибридизации может храниться при комнатной температуре, но SDS может выпасть из раствора. Если SDS осаждает осадки, разогрейте раствор в водяной бане 50 градусов до начала использования. Приготовьте не менее 100 мл каждый из 95% и 90% этанола в стерильной фильтруе воды в вымытых, автоматически хутоленных бутылках. Растворите флуоресцентно маркированные лиофилизированные зонды в 10 мм Tris-HCl (pH 8.0) и 1 мМ этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА), подготовленном в фильтровальной стерилизованной нуклеазе свободной воды до конечной концентрации 100 мкм. Подготовьте разбавление 1 мкм в буфере TE для использования в этом протоколе. Храните как 100 концентрированных запасов, так и 1 мкм запас восстановленных зондов при -20 градусов по Цельсию, защищенных от света.ПРИМЕЧАНИЕ: Не растворяйте флуоресцентно маркированные зонды в воде. Буферизация необходима для предотвращения гидролизов эстер-облигаций ГСЗ, спряживающих фторофора с нуклеотидным зондом. Очистите пять коплиновых банок с 70% этанола, дайте высохнуть, направьте следующим образом: ксилены I, ксилены II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O, и заполните 100 мл соответствующего раствора. Это поможет избежать путаницы в последующих шагах. Ткань депарафина и регидратация В капоте, поместите две горки за биопсию в вертикальную стойку слайда. Поместите вертикальную стойку слайда в банку xylenes I Coplin (содержащую 100 мл ксиленов) в течение 10 минут. Снимите стойку слайда с ксиленов I и промокните дно на бумажном полотенце, чтобы удалить излишки ксиленов. Место в ксилены II Коплин банку в течение 10 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не работайте с ксиленами за пределами сертифицированного капота дыма. Регидратные депарафафинированные участки тканей в последовательных итаноловых смканях (95% и 90%) в течение 10 минут каждый в соответственно помечены Коплин банки.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, теплый буфер гибридизации до 50-56 градусов по Цельсию в водяной бане Снимите стойку слайда с 90% этанола мыть, пятно дно на бумажные полотенца, чтобы удалить избыток этанола, и место в ddH2O Коплин банку, содержащую 100 мл фильтра стерилизованных ddH2O в течение 10 минут. В ожидании ddH2O мыть, разбавить зонды до 10 нм в буфере гибридизации для создания раствора окрашивания. Подготовьте 150 л окрашивающего раствора на слайд.ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите раствор окрашивания от света, обернув трубки в алюминиевую фольгу и храня в ящике. При работе с флуоресцентно помечены зонды на скамейке, рассмотреть вопрос о выключении накладных огней, когда это в состоянии. Зонды, разбавленные буфером гибридизации, не должны использоваться повторно. Гибридизация и контрокрасирование Подготовьте увлажняющую камеру для каждого зонда, поместив пропитанный, скомканный Кимуйп и стерильной воды в резервуар P1000 наконечник поле. Поместите картридж держателя наконечника на вершине – это где слайды будут сидеть.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать увлажняющую камеру для предотвращения высыхания участков биопсии во время гибридизации. Следует отметить, что коммерчески доступные увлажнительные камеры предназначены для поддержания стабильной, влажной атмосферы. Тем не менее, техника, описанная здесь, достаточно контролирует влажность при существенно меньших затратах. Снимите слайды со стеллажа и поместите на свежее бумажное полотенце (ткань вверх). Используйте Kimwipe, чтобы высушить слайд. Будьте осторожны, чтобы только осторожно мазок вблизи (не на) биопсии разделе фитиль от воды. Используя гидрофобную ручку, нарисуйте границу вокруг раздела биопсии и поместите слайд ткани вверх в увлажняющей камере.ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы ткани не высохли перед гибридизацией. Поместите увлажняющую камеру в инкубатор, установленный до 50 градусов по Цельсию. Пипетка 50-150 л окрашивающего раствора непосредственно на верхней части ткани, так что прямоугольник, сделанный гидрофобной границы вокруг ткани заполнен. Будьте осторожны, чтобы не добавить слишком много решения, чтобы переполнить гидрофобной границы. Закройте коробку осторожно. Инкубировать на ночь (16 ч) при 50 градусах По Цельсия в темноте. Если у инкубатора есть окно, накройте его алюминиевой фольгой, чтобы создать темную среду.ПРИМЕЧАНИЕ: Для надежного сигнала требуется температура гибридизации ниже температуры плавления зонда FISH. 50 градусов по Цельсию является оптимальной температурой для универсального зонда 16S rRNA, но не может быть оптимальным для других зондов. На следующее утро, подготовить по крайней мере 500 мл буфера мытья состоит из 0,9 М NaCl, 20 мМ Tris-HCl (pH 7.2) в ddH2O и фильтр-стерилизовать в стерильную бутылку с вакуумной бутылкой-топ фильтра. Теплый до 50-56 градусов по Цельсию на водяной бане. Удалите слайды из увлажняющих камер и тщательно фитиль от любого оставшегося решения гибридизации с Kimwipe. Поместите горки в вертикальную стойку для окрашивания. Поместите окрашивание стойки в непрозрачный Coplin банку, содержащую 100 мл предварительно подогретого буфера мыть в течение 10 минут. Если банки Коплин не являются непрозрачными (например, стекло), поместите их в темноте во время инкубационных шагов – возможно, под коробку или в ящик. Повторите шаг мытья дважды со свежим буфером мытья в новых банках Коплин. Во время мытья шаги, подготовить контр-пятно, разбавляя 100 мкг / мл бульонрешение Hoechst 33342 1:1,000 в мытье буфера. К той же трубке добавьте Алекса-555 зародышевой пшеницы агглютинин (WGA) к конечной концентрации 5 мкг/мл и Alexa-555 Phalloidin до конечной концентрации 33 нм. Хранить в темноте до готовности к использованию.ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst, Alexa-555 WGA, и Alexa-555 Phalloidin этикетке ДНК, муцин / уроплакины, и актин, соответственно, и может храниться в долгосрочной перспективе в темноте в соответствии с инструкциями производителя. Флуоресцентные метки, используемые для зондов и противоправных пятен, могут быть настроены для наборов фильтров, доступных для использования микроскопа. Удалите слайды с последней стирки и аккуратно фитиль от избыточного буфера мыть с Kimwipe. Поместите слайды ткани вверх на бумажное полотенце и добавить 50-150 л противопят прямо на верхней части ткани, так что гидрофобная граница заполнена, но не переполнены. Обложка до четырех слайдов с криобокс-топ и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Поместите стороны обратно в окрашивание стойки и мыть в два раза больше в Коплин банки со свежим буфером мыть, в течение 10 минут каждый. Тщательно высушите горки после последней стирки и поместите ткань-сторону вверх на бумажное полотенце под криобокс-топ. Сожмите одну каплю монтажа носителя непосредственно на верхней части ткани. Аккуратно поместите соответствующий размер coverslip (будет зависеть от размера биопсии) на вершине. Аккуратно нажмите на любые пузыри, как они будут вмешиваться в визуализации и позволяют крышка скольжения слайды для лечения на ночь в темноте. На следующий день, печать края крышки слайда с легким слоем прозрачного лака для ногтей. Дайте высохнуть в течение 10 минут в темноте, а затем хранить в темноте при 4 квке для конфокальной микроскопии. 3. Визуализация 16S rRNA FISH с помощью конфокальной микроскопии ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола наилучшие результаты достигаются с помощью конфокального микроскопа лазерного сканирования с 63x и 100x целями. Требуются надлежащие наборы фильтров для визуализации Hoechst, Alexa-488 и Alexa-555 fluorescence. Однако стандартная флуоресцентная микроскопия может быть использована, если конфокальный микроскоп недоступен. Этот протокол предназначен для лазерного сканирования конфокального микроскопа. Включите конфокальный микроскоп и компьютерное программное обеспечение, связанное с микроскопом в инструкции производителя. Загрузите слайд и визуализировать с целью 10x в синий (DAPI / Hoechst) канал. Сосредоточьтесь внимательно, пока не будут видны ядра. После сосредоточения, изменить цель на высокое увеличение (63x или 100x). Добавить масло поверх крышки скольжения. Переориентируйтесь с новой целью, убедившись, что объектив контакта с маслом при фокусировке.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только тонкую фокусировку при высоком увеличении (63x или 100x). Нефть должна использоваться только для достижения нефтяной цели. Быстро оценить каждый слайд через глаз кусок в зеленый (eGFP/ Alexa-488) канал, чтобы определить, какие слайды FISH положительные и которые FISH отрицательный.ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего, если эта первоначальная оценка / скоринг делается ослепленный отдельным человеком, чтобы уменьшить экспериментальные предубеждения. Чтобы изображение окрашенных биопсий, начните с FISH положительный слайд и переключиться на компьютер режим визуализации. Выберите 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555) каналов. Установите пинхол с помощью самого длинного канала длины волны, в данном случае 555. Найти правильную фокусную плоскость для визуализации помеченных бактерий в канале 488. Без изменения фокусной плоскости, установить усиление, лазерная мощность, и смещения для каждого канала так, что сигнал не насыщен, и фон не переисправлен. Приобретите изображение во всех трех каналах.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте те же настройки для канала 488 для изображения каждого слайда в эксперименте. Лазерная мощность может потребовать регулировки в 405 и 555 каналах, если оптимальная фокусная плоскость для бактериальной визуализации изменяется между полями. Повторяйте на дополнительных полях до получения изображений всей эпителиальной поверхности.ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, вам придется немного изменить фокусную плоскость, чтобы визуализировать помеченные бактерии в различных областях, но никогда не изменяйте усиление, лазерную мощность или смещение для 488-го канала между полями. При работе над конфокальный микроскоп, это может быть информативным, чтобы захватить стек, так что трехмерная локализация бактерий в ткани могут быть проанализированы. Обработка изображений и количественно помечены бактерий внутри или связанных с тканью с помощью ImageJ или аналогичного программного обеспечения. Рекомендуется минимальная обработка изображений (например, расщепление/слияние каналов и преобразование в файлы изображений), хотя при необходимости может быть выполнена коррекция фона. Все исправления или другие изменения должны оставаться последовательными между изображениями.