膀胱生検における組織常駐細菌の検出 16S rRNA 蛍光におけるインシッツハイブリダイゼーション

研究プロトコルは、UTダラスおよびUTサウスウエスタン医療センターの機関バイオセーフティおよび化学安全委員会のガイドラインによって承認され、それに従いました。このプロトコルにおけるヒト被験者からの生検の使用は、UTダラスおよびUTサウスウエスタン医療センターの機関審査委員会のガイドラインによって承認され、それに従った。生検の収集と処理に関与するすべての個人は、現在のヒト被験者保護(HSP)とHIPPAトレーニングを持っています。 1. 固定およびパラフィン埋め込みのための組織製剤 注:生検は、再発性尿路感染症(rUTI)の高度な管理のための三価状炎の電気フルグレーションを有する膀細胞鏡検査を受けている女性の同意から採取された。rUTI は、12 か月の期間で 3 つの UTI として定義されます。生検回収は、UTSW IRBプロトコルSTU 0TU 082010-016に基づいてインフォームされた患者の同意を得た後、患者が麻酔下にある間に手術室で行われた。すべてのサンプルは、実験前にコード化され、識別解除されました。 フレキシブル嚢胞鏡を介して泌尿器系鉗子を用いた膀胱トリネからコールドカップ(〜1mm3)の生検を得て、1x無菌リン酸緩衝生理食生で調製した4%v/vパラホルムアルデヒド(PFA)の1.5mLを含む無菌2 mL凍結に直ちに入れます。(PBS)を使用します。注:1x PBSの4%のPFAは、事前に作られ、必要になるまで-20 °Cで保存することができます。 室温で6時間、または4°Cで16-24hの生検を修正します。注:固定期間は、組織サンプルのサイズに基づいて計算され、過剰固定は避けるべきです。それは自己蛍光を導入する固定剤としてグルタルアルデヒドを使用することはお勧めしません。 殺菌されたフードまたはバイオセーフティキャビネットで、ピペッティングによって固定性を取り除き、無菌1x PBSの1.5 mLに置き換えます。サンプルを一晩4°Cに保つか、すぐに組織処理とパラフィン埋め込みを行う19. 5 μmの厚さで組織ブロックをセクションし、パラフィン組織セクションを帯電ガラス顕微鏡スライドに付着させるために殺菌されたマイクロトームを使用します。16S rRNA FISH プロトコルには、生検ごとに少なくとも 2 つのスライドが必要です。注:生検組織は、すべてのセクションで尿路上皮層の視覚化を確実にするために、切断面に対して断面的に配置する必要があります。また、セクションの厚さは細菌のコミュニティ検出のために最適化されるべきであることに留意すべきです。組織常在細菌が非常に少ない感染症の場合(例えば、1,000人の哺乳動物細胞当たり<1組織常在細菌)の場合には、より薄い切片または複数の連続切片のサンプリングが必要となる場合があります。 2. ユニバーサル16S rRNAプローブを用した在分事ハイブリダイゼーションにおける蛍光 注:生検ごとに2枚のスライドが必要です。ユニバーサル16S rRNAプローブには1つのスライド、スクランブルシーケンスを持つ制御プローブには1つのスライドが必要です。膀胱上皮は複数のチャネルで自動蛍光であるため、顕微鏡検査中に真の信号とバックグラウンド信号を区別するために重要です。スクランブルプローブに加えて、取り付け前に0.1%スーダンブラックBでブロッキングは、組織20に内在するバックグラウンド自己蛍光を減少させる可能性がある。 試薬およびヒュームフードの調製 70%のエタノールで空のヒュームフード(または適切にフィットしたバイオセーフティキャビネット)をきれいにします。 0.9M塩化ナトリウム(NaCl)、20mMトリス-HCl(pH 7.2)、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)からなるハイブリダイゼーションバッファーを10mLの滅菌濾過水で調製する。注:滅菌濾過水は、0.22 μMフィルターを介してオートクレーブ蒸留水を通過させることによって調製することができる。ハイブリダイゼーションバッファは室温で保存できますが、SDSは溶液から沈殿する場合があります。SDSが沈殿する場合は、使用前に50°Cの水浴で溶液を温めます。 洗浄されたオートクレーブボトルで無菌濾過水に95%と90%エタノールのそれぞれ少なくとも100 mLを調製します。 蛍光標識凍結乾燥プローブを10mMトリス-HCl(pH8.0)および1mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)バッファー(TE)で溶解し、フィルター殺菌ヌクレアーゼフリーウォーターで調製し、最終的な濃度100μMにする。このプロトコルで使用するために、TE バッファに 1 μM の希釈を準備します。100 μM濃縮ストックと1 μMストック再構成プローブの両方を、光から保護された-20°Cで保管してください。注:蛍光標識プローブを水中に溶解させないようにしてください。緩衝は、フッ素をヌクレオチドプローブに結合させるNHSエステル結合の加水分解を防止するために必要である。 70%エタノールで5コプリン瓶をきれいにし、乾燥させ、次のようにラベルを貼ります:キシレンI、キシレンII、95%EtOH、90%EtOH、ddH2 O、および適切な溶液の100 mLで満たします。これは、後の手順で混乱を避けるのに役立ちます。 組織脱パラフィン化と水分補給 フードに、生検ごとに2枚のスライドを垂直スライドラックに入れます。 垂直スライドラックをキシレンIコプリン瓶(キシレン100mLを含む)に10分間置きます。 キシレンIからスライドラックを取り外し、ペーパータオルの底部をブロットして余分なキシレンを取り除きます。キシレンIIコプリン瓶に10分間入れます。注:認証されたヒュームフードの外でキシレンと一緒に働かすことはありません。 連続したエタノール洗い(95%および90%)で脱パラフィン化組織切片を再水和するそれぞれ10分間、コプリン瓶にラベルが付いています。注:この段階の間、水浴中の50-56 °Cに暖かいハイブリダイゼーションバッファー 90%エタノール洗浄からスライドラックを取り外し、余分なエタノールを取り除くためにペーパータオルの底部をブロットし、100 mLのフィルター殺菌ddH2Oを含むddH2Oコプリン瓶に10分間置きます。 ddH2O洗浄を待っている間、ハイブリダイゼーションバッファー内のプローブを10nMに希釈して染色液を作成します。スライドごとに150μLの染色溶液を準備します。注:チューブをアルミホイルで包み、引き出しに収納することで、光から汚れ溶液を保護します。ベンチトップで蛍光色のラベル付きプローブを使用する場合は、可能な場合はオーバーヘッドライトをオフにすることを検討してください。ハイブリダイゼーションバッファーで希釈されたプローブは再利用しないでください。 ハイブリダイゼーションとカウンター染色 P1000チップボックスの貯水池に浸した、くしゃくしゃになったキムワイプと滅菌水を配置することにより、各プローブのための加湿室を準備します。先端ホルダーカートリッジを上に置きます – これはスライドが座る場所です。注:ハイブリダイゼーション中に生検セクションが乾燥するのを防ぐために加湿室を使用することが重要です。市販の加湿器室は、安定した湿度の高い雰囲気を維持するように設計されていることに留意すべきである。しかし、ここで詳述した技術は、実質的に低コストで湿度を十分に制御します。 スライドラックからスライドを取り外し、新しいペーパータオル(ティッシュサイドアップ)に置きます。Kimwipe を使用してスライドを乾かします。生検部の近くに(上ではなく)穏やかに塗るだけで水を取り除くだけに注意してください。疎水性ペンを使用して、生検部の周りに境界線を描き、加湿室にスライドティッシュ側を上に置きます。注:ハイブリダイゼーションの前に組織が乾燥しないように迅速に作業します。 加湿室を50°Cに設定したインキュベーターに入れ。組織の上に直接染色溶液のピペット50〜150 μLは、組織の周りの疎水性境界によって作られた長方形が充填されるようにする。疎水性の境界線をオーバーフローするようにあまりにも多くの溶液を追加しないように注意してください。ボックスをゆっくりと閉じます。 暗闇の中で50°Cで一晩(~16時間)インキュベートします。インキュベーターに窓がある場合は、アルミホイルで覆い、暗い環境を作り出します。注:信頼性の高い信号には、FISHプローブの溶融温度以下のハイブリダイゼーション温度が必要です。50 °Cは、ユニバーサル16S rRNAプローブに最適な温度ですが、他のプローブには最適ではない場合があります。 翌朝、dH2O で 0.9 M NaCl、20 mM Tris-HCl (pH 7.2) で構成される洗浄バッファーの少なくとも 500 mL を準備し、真空ボトルトップ フィルターを使用して滅菌ボトルに滅菌します。水風呂で50~56°Cに温めます。 加湿室からスライドを取り外し、Kimwipeで残りのハイブリダイゼーションソリューションを慎重に取り除きます。スライドを垂直染色ラックに置きます。 染色ラックを10分間、100mLの予め温めた洗浄バッファーを含む不透明なコプリン瓶に入れます。コプリンの瓶が不透明でない場合(例えば、ガラス)、インキュベーションステップ中に暗闇の中に置きます- おそらく箱の下または引き出しの下に。 新しいコプリン瓶の新鮮な洗浄バッファーで洗浄ステップを2回繰り返します。 洗浄工程の間に、洗浄バッファーでHoechst 33342 1:1,000の100 μg/mLストック溶液を希釈してカウンターステインを調製する。同じチューブに、Alexa-555小麦胚芽アグルチニン(WGA)を5μg/mLの最終濃度に加え、Alexa-555ファロイジンを33nMの最終濃度に加えます。使用する準備ができるまで暗闇の中で保管してください。注:Hoechst、Alexa-555 WGA、およびAlexa-555ファロイジンラベルDNA、ムチン/ウロプラキン、アクチンは、それぞれ、メーカーの指示に従って暗闇の中で長期間保存することができます。プローブおよびカウンターステインに使用される蛍光ラベルは、顕微鏡で使用できるフィルターセット用にカスタマイズできます。 最後の洗浄からスライドを取り外し、Kimwipeで余分な洗浄バッファーをそっと拭き取ります。スライドティッシュをペーパータオルの上に置き、50-150 μLのカウンターステインを組織の上に直接加えて、疎水性の境界線が満たされますが、あふれないようにします。クライオボックストップで最大4枚のスライドをカバーし、室温で10分間インキュベートします。 側面を染色ラックに戻し、コプリンの瓶に新鮮な洗浄バッファーを入れ、それぞれ10分間洗います。 最後の洗濯後にスライドを完全に乾燥させ、ティッシュサイドをペーパータオルの上に置き、クライオボックストップの下に置きます。取り付けメディアを1滴、ティッシュの上に直接絞ります。適切なサイズのカバースリップ(生検サイズに依存します)を上にゆっくりと置きます。彼らはイメージングを妨げ、カバー滑ったスライドが暗闇の中で一晩治癒することを可能にするので、穏やかに任意の気泡を押し出します。 翌日、カバースリップの端を透明なマニキュアの軽いコートでスライドにシールします。暗闇の中で10分間乾燥させ、共焦点顕微鏡のために4°Cで暗闇の中に保存します。 3. 共焦点顕微鏡による16S rRNA FISHの可視化 注:このプロトコルのために、最良の結果は63xおよび100xの目的のレーザー走査の共焦点顕微鏡によって達成される。Hoechst、Alexa-488、およびAlexa-555蛍光の可視化のための適切なフィルタセットが必要です。ただし、共焦点顕微鏡が使用できない場合は、標準的な蛍光顕微鏡を使用できます。このプロトコルはレーザー走査共焦点顕微鏡用である。 製造元の指示に従って、顕微鏡に関連付けられている共焦点顕微鏡とコンピュータソフトウェアのスイッチをオンにします。 スライドをロードし、青色(DAPI/Hoechst)チャネルの10倍の目標で視覚化します。核が見えるまで注意深く焦点を合わせなさい。 フォーカスができたら、目的を高倍率(63倍または100倍)に変更します。カバースリップの上にオイルを追加します。新しい目的に焦点を合わせ、焦点を合わせながら対物レンズが油と接触することを確認します。注:高倍率(63倍または100倍)でのファインフォーカスのみを使用してください。石油は、石油目的にのみ使用する必要があります。 緑色(eGFP/Alexa-488)チャンネルのアイピースを通して各スライドを素早く評価し、FISH陽性のスライドとFISH負のスライドを特定します。注:この初期評価/スコアリングは、実験的バイアスを減らすために別の個人によって盲目に行われる場合に最適です。 染色された生検をイメージするには、FISH陽性スライドから始めて、コンピュータの視覚化モードに切り替えます。405(ホエシュト)、488(Alexa-488)、555(Alexa-555)チャンネルを選択します。この場合は555の最長波長チャネルを使用してピンホールを設定する。488チャンネルで標識細菌の可視化のための正しい焦点面を見つけます。焦点面を変更せずに、信号が飽和せず、背景が過剰に補正されないような、各チャンネルのゲイン、レーザーパワー、オフセットを設定します。3 つのチャンネルすべてで画像を取得します。注:488 チャンネルで同じ設定を使用して、実験のすべてのスライドをイメージします。細菌可視化に最適な焦点面がフィールド間で変化する場合、レーザーパワーは405チャンネルと555チャンネルで調整を必要とする場合があります。 上皮表面全体の画像を取得するまで、追加のフィールドで繰り返します。注:異なるフィールドで標識された細菌を視覚化するには、焦点面を少し変更する必要がありますが、フィールド間の 488 チャネルのゲイン、レーザーパワー、またはオフセットは変更しないでください。共焦点顕微鏡で作業する場合、組織内の細菌の三次元局在化を分析できるようにZスタックを捕捉することが有益である場合があります。 画像を処理し、ImageJまたは同様のソフトウェアを使用して、組織内または組織に関連する標識細菌を定量化します。必要に応じて、画像の最小処理(チャンネルの分割/マージ、画像ファイルへの変換など)をお勧めします。すべての修正またはその他の変更は、画像間で一貫性を保つ必要があります。