Détection de bactéries résidentes dans les tissus dans les biopsies de la vessie par fluorescence de l'ARNr1 16S In Situ Hybridization

Le protocole d’étude a été approuvé et a suivi les lignes directrices des comités institutionnels de biosécurité et de sécurité chimique de l’UT Dallas et du Centre médical du Sud-Ouest de l’UT. L’utilisation des biopsies des sujets humains dans ce protocole a été approuvée par et a suivi les directives des conseils institutionnels d’examen de l’UT Dallas et du centre médical du sud-ouest de l’UT. Toutes les personnes impliquées dans la collecte et le traitement de biopsie ont la protection humaine courante de sujet (HSP) et la formation de HIPPA. 1. Préparation des tissus pour la fixation et l’emcasterie de paraffine REMARQUE: Des biopsies ont été prises des femmes consentantes subissant la cystoscopie avec l’électro-fulguration de trigonitis pour la gestion avancée de l’infection urinaire récurrente (rUTI). rUTI est défini comme 3 infections urinaires sur une période de 12 mois. La collecte de biopsie a été exécutée dans la salle d’opération tandis que le patient était sous anesthésie après avoir obtenu le consentement informé de patient par protocole d’IRB d’UTSW STU 082010-016. Tous les échantillons ont été codés et dé-identifiés avant l’expérimentation. Obtenir une tasse froide (1 mm3) biopsie de la vessie trigone avec des forceps urologiques via cystoscope flexible et placer immédiatement dans un cryovial stérile de 2 ml contenant 1,5 mL de 4% v/v paraformaldehyde (PFA) préparé en 1x phosphate stérile tamponné salin (PBS).REMARQUE : 4 % de PFA en 1x PBS peuvent être faits à l’avance et stockés à -20 oC jusqu’à ce que nécessaire. Fixer la biopsie de 6 h à température ambiante ou de 16 à 24 h à 4 oC.REMARQUE: La durée de fixation doit être calculée en fonction de la taille de l’échantillon de tissu et la surfixation doit être évitée. Il n’est pas conseillé d’utiliser le glutaraldéhyde comme fixatif car il introduit l’autofluorescence. Dans une hotte stérilisée ou une armoire de biosécurité, retirer le fixatif par pipetting et remplacer par 1,5 ml de 1x PBS stérile. Gardez les échantillons à 4 oC pendant la nuit ou effectuez immédiatement le traitement des tissus et l’incorporation de paraffine19. Utilisez un microtome stérilisé pour sectionr les blocs de tissu d’une épaisseur de 5 m et adhérez les sections de tissu de paraffine aux lames de microscope en verre chargées. Un minimum de deux diapositives par biopsie sera nécessaire pour le protocole 16S rRNA FISH.REMARQUE: Le tissu de biopsie doit être disposé de section croisée par rapport au plan de coupe afin d’assurer la visualisation des couches urothéliales dans toutes les sections. Il convient également de noter que l’épaisseur de la section devrait être optimisée pour la détection des communautés bactériennes. Des sections plus minces ou un échantillonnage de plusieurs sections en série peuvent être nécessaires dans le cas d’infections où les bactéries résidentes de tissus sont extrêmement rares (p. ex., la bactérie résidente des tissus par 1 000 cellules de mammifères). 2. Fluorescence In Situ Hybridization avec universal 16S rRNA Probes REMARQUE: Deux diapositives par biopsie sont nécessaires. Une diapositive est nécessaire pour la sonde rRNA 16S universelle et une diapositive pour une sonde de contrôle avec une séquence brouillée. Ceci est important pour distinguer le vrai signal du signal de fond pendant la microscopie puisque l’épithélium de réservoir souple est auto-fluorescent dans plusieurs canaux. En plus de la sonde de brouillage, le blocage avec 0,1% Soudan Black B avant le montage peut réduire l’autofluorescence de fond inhérente au tissu20. Préparation des réactifs et du capot de fumée Nettoyez une hotte de fumée vide (ou une armoire de biosécurité convenablement équipée) avec 70 % d’éthanol. Préparer le tampon d’hybridation composé de 0,9 M de chlorure de sodium (NaCl), de 20 mM de Tris-HCl (pH 7,2), de 0,1 % de sulfate de dodécyl de sodium (SDS) dans 10 ml d’eau filtrée stérile.REMARQUE: L’eau filtrée par les stériles peut être préparée en passant de l’eau distillée autoclave d’un filtre de 0,22 M. Le tampon d’hybridation peut être stocké à température ambiante, mais le SDS peut précipiter de la solution. Si le SDS se précipite, réchauffez la solution dans un bain d’eau de 50 oC avant de l’utiliser. Préparer au moins 100 ml chacun de 95 % et 90 % d’éthanol dans de l’eau filtrée stérile dans des bouteilles lavées et autoclavées. Dissoudre les sondes lyophilisées étiquetées fluorescentes dans 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) et 1 mM d’acide éthylènediaminetetraacetic acid (EDTA) tampon préparé dans de l’eau sans nucléarisation filtrée à une concentration finale de 100 M. Préparer une dilution de 1 M dans le tampon TE pour une utilisation dans ce protocole. Entreposez les sondes reconstituées de 100 m et de 1 million de sondes reconstituées à -20 oC, protégées de la lumière.REMARQUE: Ne pas dissoudre les sondes étiquetées fluorescentes dans l’eau. La mise en mémoire tampon est nécessaire pour empêcher l’hydrolyse de la liaison de l’ester nhs conjuguant le fluorophore à la sonde nucléotide. Nettoyer cinq pots De Coplin avec 70% d’éthanol, laisser sécher, étiqueter comme suit: xylènes I, xylènes II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O, et remplir avec 100 ml de la solution appropriée. Cela permettra d’éviter la confusion dans les étapes ultérieures. Déparaisonetisation et réhydratation des tissus Dans le capot, placez deux diapositives par biopsie dans un plan vertical. Placez un plan de glissière vertical dans le bocal xylènes I Coplin (contenant 100 ml de xylènes) pendant 10 min. Retirez le rack de glissière des xylènes I et épongez le fond sur une serviette en papier pour enlever l’excès de xylènes. Placer dans le pot de xylènes II Coplin pendant 10 min.REMARQUE: Ne jamais travailler avec des xylènes à l’extérieur d’une hotte de fumée certifiée. Réhydrater les sections de tissus déparaffinisées dans les lavages successifs d’éthanol (95 % et 90 %) pendant 10 min chacun dans les pots de Coplin étiquetés respectivement.REMARQUE: Pendant cette étape, tampon d’hybridation chaude à 50-56 oC dans un bain d’eau Retirez le support à glissière du lavage à 90 % d’éthanol, épongez le fond sur des essuie-tout pour enlever l’excès d’éthanol et placez-le dans le pot ddH2O Coplin contenant 100 ml de ddH2O filtrant pendant 10 min. En attendant le lavage ddH2O, diluer les sondes à 10 nM dans un tampon d’hybridation pour créer la solution de coloration. Préparer 150 L de solution de coloration par diapositive.REMARQUE: Protégez la solution de coloration de la lumière en enveloppant les tubes dans du papier d’aluminium et en les rangeant dans un tiroir. Lorsque vous travaillez avec des sondes étiquetées fluorescentes sur le banc, envisagez d’éteindre les lumières aériennes lorsque vous le jugez. Les sondes diluées dans le tampon d’hybridation ne doivent pas être réutilisées. Hybridation et contre-staining Préparer une chambre humidifiante pour chaque sonde en plaçant de l’eau imbibée et froissée Kimwipe et stérile au réservoir d’une boîte de pointe P1000. Placez la cartouche porte-boutsur le dessus – c’est là que les diapositives seront assis.REMARQUE: Il est important d’utiliser une chambre d’humidification pour empêcher les sections de biopsie de se dessécher pendant l’hybridation. Il convient de noter que les chambres d’humidificateur disponibles dans le commerce sont conçues pour maintenir une atmosphère stable et humide. Cependant, la technique détaillée ici contrôle suffisamment l’humidité à un coût nettement inférieur. Retirer les glissières du toboggan et les placer sur un essuie-tout frais (côté tissu vers le haut). Utilisez un Kimwipe pour sécher la lame. Veillez à ne tamponner doucement près (pas sur) la section de biopsie pour évacuer l’eau. À l’aide d’un stylo hydrophobe, tracer une bordure autour de la section de biopsie et placer le côté tissu coulissant vers le haut dans la chambre d’humidification.REMARQUE: Travaillez rapidement pour que les tissus ne se dessèchent pas avant l’hybridation. Placer la chambre d’humidification dans un incubateur réglé à 50 oC. Pipette 50-150 l de la solution de coloration directement sur le dessus du tissu de sorte que le rectangle fait par la bordure hydrophobe autour du tissu est rempli. Veillez à ne pas ajouter trop de solution pour déborder la frontière hydrophobe. Fermez la boîte doucement. Incuber toute la nuit (16 h) à 50 oC dans l’obscurité. Si l’incubateur a une fenêtre, couvrez-la de papier d’aluminium pour créer un environnement sombre.REMARQUE: Une température d’hybridation inférieure à la température de fonte de la sonde FISH est nécessaire pour un signal fiable. La température optimale de la sonde 16S est optimale, mais elle n’est peut-être pas optimale pour les autres sondes. Le lendemain matin, préparer au moins 500 ml de tampon de lavage composé de 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) en ddH2O et filtrer-stériliser dans une bouteille stérile avec un filtre à vide. Chauffer à 50-56 oC dans un bain d’eau. Retirez les glissières des chambres d’humidification et éliminez soigneusement toute solution d’hybridation restante à l’aller avec un Kimwipe. Placer les glissières dans un support de coloration vertical. Placer la grille de coloration dans un bocal Coplin opaque contenant 100 ml de tampon de lavage préréchauffé pendant 10 min. Si les pots de Coplin ne sont pas opaques (p. ex. verre), placez-les dans l’obscurité pendant les étapes d’incubation — peut-être sous une boîte ou dans un tiroir. Répétez l’étape de lavage deux fois avec un tampon de lavage frais dans de nouveaux pots Coplin. Pendant les étapes de lavage, préparer la contre-tache en diluant une solution de 100 g/mL de bouillon de Hoechst 33342 1:1,000 dans le tampon de lavage. Dans le même tube, ajouter l’agglutinine du germe de blé Alexa-555 (WGA) à une concentration finale de 5 g/mL et la phalloidin Alexa-555 à une concentration finale de 33 nM. Conserver dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.REMARQUE: Hoechst, Alexa-555 WGA, et Alexa-555 Phalloidin étiquette ADN, mucine / uroplakins, et l’actine, respectivement et peut être stocké à long terme dans l’obscurité selon les instructions du fabricant. Les étiquettes fluorescentes utilisées pour les sondes et les contre-taches peuvent être personnalisées pour les ensembles de filtres disponibles pour le microscope à utiliser. Retirez les diapositives du dernier lavage et évacuez doucement l’excédent de tampon de lavage à l’œil d’un Kimwipe. Placez les diapositives côté tissu vers le haut sur un essuie-tout et ajoutez 50-150 l de contre-tache directement sur le dessus du tissu de sorte que la bordure hydrophobe soit remplie, mais pas débordante. Couvrez jusqu’à quatre diapositives d’un dessus cryobox et incubez 10 min à température ambiante. Remettre les côtés dans la grille de coloration et laver deux fois plus dans des bocaux Coplin avec un tampon de lavage frais, pendant 10 min chacun. Séchez soigneusement les lames après le dernier lavage et placez le côté tissulaire vers le haut sur une serviette en papier sous un cryobox-top. Presser une goutte de support de montage directement sur le dessus du tissu. Placez délicatement un bordereau de taille appropriée (dépendra de la taille de la biopsie) sur le dessus. Appuyez doucement sur les bulles car elles interfèrent avec l’imagerie et permettent aux glissières glissées par le couvercle de guérir toute la nuit dans l’obscurité. Le lendemain, scellez les bords de la glissière à la glissière avec une légère couche de vernis à ongles clair. Laisser sécher 10 min dans l’obscurité, puis conserver à l’obscurité à 4 oC pour une microscopie confocale. 3. Visualisation de 16S rRNA FISH par Microscopie Confocal REMARQUE: Pour ce protocole, les meilleurs résultats sont obtenus avec un microscope confocal à balayage laser avec des objectifs 63x et 100x. Des ensembles de filtres appropriés pour la visualisation de Hoechst, Alexa-488 et Alexa-555 fluorescence sont nécessaires. Cependant, la microscopie fluorescente standard peut être utilisée si un microscope confocal n’est pas disponible. Ce protocole est pour un microscope confocal de balayage laser. Allumez le microscope confocal et le logiciel informatique associé aux instructions du microscope par fabricant. Chargez la diapositive et visualisez avec l’objectif 10x dans le canal bleu (DAPI/Hoechst). Concentrez-vous soigneusement jusqu’à ce que les noyaux soient visibles. Une fois concentré, changer l’objectif à un grossissement élevé (63x ou 100x). Ajouter l’huile sur le dessus de la feuille de couverture. Recentrer avec le nouvel objectif, en s’assurant que la lentille objective entre en contact avec l’huile tout en se concentrant.REMARQUE: Utilisez uniquement la mise au point fine à un grossissement élevé (63x ou 100x). Le pétrole ne doit être utilisé que pour un objectif pétrolier. Évaluez rapidement chaque diapositive à travers l’œil-pièce dans le canal vert (eGFP/Alexa-488) pour déterminer quelles diapositives sont positives FISH et qui sont négatives FISH.REMARQUE: Il est préférable que cette évaluation initiale ou la notation soit effectuée à l’aveuglepar par une personne distincte afin de réduire les biais expérimentaux. Pour imager les biopsies tachées, commencez par une diapositive positive FISH et passez au mode de visualisation par ordinateur. Sélectionnez les canaux 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Définir le trou d’épingle en utilisant le canal de longueur d’onde le plus long, dans ce cas 555. Trouvez le plan focal correct pour la visualisation des bactéries étiquetées dans le canal 488. Sans changer le plan focal, définir le gain, la puissance laser, et le décalage pour chaque canal de sorte que le signal n’est pas saturé, et l’arrière-plan n’est pas sur-corrigé. Acquérir l’image dans les trois canaux.REMARQUE: Utilisez les mêmes paramètres pour le canal 488 pour imager chaque diapositive d’une expérience. La puissance laser peut nécessiter un ajustement dans les canaux 405 et 555 si le plan focal optimal pour la visualisation bactérienne change entre les champs. Répétez sur d’autres champs jusqu’à l’acquisition d’images de toute la surface épithéliale.REMARQUE: Vous devrez peut-être changer légèrement le plan focal pour visualiser les bactéries étiquetées dans différents champs, mais ne modifiez jamais le gain, la puissance laser ou le décalage pour le canal 488 entre les champs. Si vous travaillez sur un microscope confocal, il peut être instructif de capturer une pile Z afin que la localisation tridimensionnelle des bactéries dans le tissu peut être analysée. Traiter les images et quantifier les bactéries étiquetées à l’intérieur ou associées au tissu à l’aide d’ImageJ ou d’un logiciel similaire. Un traitement minimal des images est recommandé (p. ex., fractionnement/fusion des canaux et conversion en fichiers d’images), bien que la correction de fond puisse être effectuée si nécessaire. Toutes les corrections ou autres modifications doivent rester cohérentes entre les images.