الكشف عن البكتيريا المقيمة في الانسجه في المثانة الخزعات من قبل rRNA الفلورية 16S في الموقع التهجين
Summary
هذا البروتوكول هو للكشف عن غير منحازة من البكتيريا المرتبطة الانسجه في الخزعات المريض بواسطة rRNA 16S في التهجين الموضعي والمجهر البؤري.
Abstract
يمكن ان يوفر تصور تفاعل البكتيريا مع الأسطح المخاطية المضيفة والانسجه رؤية قيمه في أليات التسبب في المرض. في حين ان تصور مسببات الامراض البكتيرية في النماذج الحيوانية للعدوى يمكن ان يعتمد علي سلالات بكتيرية مصممه للتعبير عن البروتينات الفلورية مثل GFP ، فان تصور البكتيريا داخل الغشاء المخاطي للخزعات أو الانسجه التي يتم الحصول عليها من المرضي البشريين يتطلب طريقه غير متحيزة. هنا ، نقوم بوصف طريقه فعاله للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه في أقسام الخزعة البشرية. يستخدم هذا الأسلوب الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH) مع فلوريسسينتلي المسمي المسبار العالمي اوليغكليوكليوتيد ل 16S rRNA لتسميه البكتيريا المرتبطة بالانسجه داخل أقسام خزعة المثانة المكتسبة من المرضي الذين يعانون من المتكررة عدوي المسالك البولية. من خلال استخدام المسبار العالمي لل rrna 16s ، يمكن الكشف عن البكتيريا دون معرفه مسبقه من الأنواع ، أجناس ، أو الخصائص البيوكيميائية ، مثل عديد السكاريد (lps) ، التي ستكون مطلوبه للكشف عن طريق التجارب المناعية. نحن وصف بروتوكول كامل ل 16S rRNA الأسماك من تثبيت الخزعة إلى التصوير عن طريق المجهر البؤري. ويمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام في اي نوع من الانسجه تقريبا ويمثل أداه قويه لتصور غير متحيز من التفاعلات البكتيرية المضيفة ذات الصلة سريريا في انسجه المريض. وعلاوة علي ذلك ، باستخدام الأنواع أو المجسات الخاصة بالأجناس ، يمكن تكييف هذا البروتوكول للكشف عن مسببات الامراض البكتيرية المحددة داخل انسجه المريض.
Introduction
المسالك البولية ، التي تتكون من مجري البول والمثانة والحالب والكلي يتعرض باستمرار للبكتيريا التي تشكل ميكروبيوم البولية ، فضلا عن الغازية المسببة للامراض البولية ، مثل الامراض البولية الجرثومية e. القولونية (upec) ، من الجهاز الهضمي 1،2. طبقه من المخاط الرطب تتكون من الغليكوسامينوجليكانز ولوحه غير نفاذه من البروتينات البولية الغليكولاتيد التي تم التعبير عنها علي سطح الخلايا السطحية تشكل حاجزا يحمي بشكل روتيني ظهاره المثانة من الغزو من قبل المنضمين بكتيريا3،4. اثناء عدوي المسالك البولية (UTI) ، يتم إزعاج هذه الحواجز أو تدميرها ، مما يسهل التعلق بظهاره المثانة وغزوها من قبل البكتيريا المسببة للامراض البولية5،6. وقد كشف العمل في نماذج murine ان العديد من البكتيريا المسببة للامراض البولية بما في ذلك upec ، klebsiella الرئوية، والمكورات المعوية البرازيه يمكن ان تشكل المجتمعات الخلوية المتماثلة (الحاويات الوسيطة) داخل سيتوتوبلاسما من الخلايا السطحية الخزانات داخل الخلية الهادئة (qirs) ضمن الخلايا الظهاريه الانتقالية7،8،9. علي الرغم من ان UPEC قد تم التعرف عليها داخل سفك الخلايا الظهاريه من المرضي UTI الإنسان ، والتفاعل من مسببات الامراض البولية مع الغشاء المخاطي المثانة في البشر لم يسبق تصوره10.
قمنا بتكييف تقنيه مشتركه ، مضانه في التهجين الموضعي (FISH) ، للكشف عن البكتيريا داخل الغشاء المخاطي لخزعات المثانة التي تم الحصول عليها من المرضي بعد سن إلياس الذين خضعوا لتنظير المثانة بالكهرباء من التهاب الأوتار الثلاثية (CEFT) للمتقدمين أداره المضادات الحيوية الحرارية المتكررة UTI11. باستخدام مسبار عالمي ل rRNA 16S, كنا قادرين علي الكشف بموضوعيه الأنواع البكتيرية المرتبطة بالغشاء المخاطي المثانة من المرضي UTI المتكررة وتحديد موقفهم داخل جدار المثانة12. وقد تم تصميم المسبار النيوكليوتيد العالمي 16S rRNA لاستهداف منطقه المحمية من البكتيريا 16S rRNA13، الذي يتوافق مع المواقع 388-355 من القولونية rrna 16S. وقد تم التحقق من تسلسل rrna 16s والتدافع التحقيق سابقا ونشرت للاستخدام في الجهاز الهضمي الماوس14,15. ويرد وصف لمتواليات وخصائص التحقيقات في الجدول 1. من الضروري استخدام قسمين متسلسلين في هذا البروتوكول ، أحدهما لمسبار rRNA 16S والاخر لمسبار التدافع ، ليكون قادرا علي التمييز بين الاشاره الصحيحة والخلفية كظهاره المثانة ، والكولاجين والايلاستين المعرض التلقائي16 . في هذا البروتوكول ، تم تصميم rRNA 16S والتدافع التحقيقات مع الفلورسنت اليكسا فلور 488 التسميات علي حد سواء في 3 ‘ و 5 ‘ تيرميني عن طريق N-هيدروكسيسكالنجيد (نهس) استر الروابط لزيادة اشاره الفلورسنت.
علي الرغم من انه تم تطوير هذا البروتوكول لاستخدامه علي أقسام خزعة المثانة البشرية ، فانه يمكن تكييفه بسهوله للاستخدام علي الأقسام المضمنة في البارافين من اي نسيج يعتقد ان البكتيريا تقيم فيه. علي عكس التجارب مناعي التي تستهدف المستضدات محدده (علي سبيل المثال ، lipopolysساكاريد) علي سطح البكتيريا ، وهذا الأسلوب لا يتطلب اي معرفه مسبقه من المستضدات التي أعربت عنها البكتيريا المرتبطة بالانسجه10،17 . استخدام المسبار العالمي لل rRNA 16S يسمح الكشف غير متحيزة لجميع الأنواع البكتيرية داخل العينة ولكن لا يسمح تحديد هويتهم. لتحديد التعرف علي البكتيريا المكتشفة ، يجب استخدام الأنواع أو الكائنات الخاصة بالجنس أو النوع 16S أو 23S rRNA. هذا البروتوكول لن يكشف أيضا عن مسببات الامراض الفطرية ، مثل المبيضات الbicans، المرتبطة بالانسجه المضيفة. للكشف عن مسببات الامراض الفطرية ، 28S أو 18S rRNA تحقيقات يجب ان تستخدم18.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، ونحن وصف بروتوكول للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه في الخزعات المثانة البشرية من قبل الجيش النيبالي الريبي 16S FlSH. ويمكن تكييف هذا البروتوكول بسهوله لأخذ الخزعات الماخوذه من الانسجه الأخرى ، مثل الجهاز الهضمي أو الجلد ، ويمكن ان يمتد إلى الانسجه التي تحصد من مجموعه متنوعة من الكائنات الحية النموذجية الثدييات. ويمكن أيضا تكييف البروتوكول الموصوف هنا لاستخدام تثبيت متعدد (علي سبيل المثال ، formalin ، الايثانول ، ميثاكارن) وتقنيات اعداد الانسجه (مثل البارافين أو الراتنج جزءا لا يتجزا ، والانسجه الباكية). المزدوج المسمي العالمي 16S rRNA المسبار يسمح للكشف عن غير متحيزة من جميع الأنواع البكتيرية الموجودة داخل الانسجه ، ويمكن ان توفر نظره قيمه في كيفيه مسببات الامراض والميكروبات تتفاعل مكانيا مع الأسطح المخاطية في المرض وصحية الدول. استخدام الموارد مثل probeBase ، PhylOPDb أو أداه PROBE_DESIGN لحزمه البرمجيات ارب لاختيار أو تصميم الأنواع أو أجناس الخاصة 16S أو 23S التحقيقات rRNA ، ويمكن تكييف هذا البروتوكول للكشف عن الأنواع البكتيرية محدده أو أجناس داخل الانسجه15،21،22. وثمة اتجاه هام في المستقبل لهذه الطريقة هو تعدد الإرسال باستخدام الأنواع-أو التحقيقات الخاصة بالأجناس المسمية بمختلف ، فلوبهورس منفصلة لتقييم التنوع الميكروبي داخل الغشاء المخاطي للمثانة.
القيد الأساسي لهذه الطريقة للاستخدام علي العينات البشرية هو توافر الانسجه البيولوجية. ان موافقه مجلس المراجعة المؤسسية وموافقه المريض المستنيرة مطلوبه للحصول علي الخزعات والتعاون المباشر مع الطبيب الذي يؤدي الاجراء ضروري لجمع العينات المثلي والوصول إلى البيانات الوصفية للمريض. الاجراء CEFT نفسه يدمر ظهاره المثانة لذلك كنا قادرين علي تبرير خزعة من هذه المناطق قبل الاجراء. مطلوب لهذا البروتوكول غطاء الدخان أو خزانه السلامة الاحيائيه المجهزة بشكل مناسب بسبب استخدام الاكزينات السامة في خطوه المغادرين والحاجة إلى الحفاظ علي بيئة معقمه طوال الاجراء. المجهر الفلورسنت ، ويفضل ان يكون التنسيق ، مع 63x أو 100x الهدف ومجموعات مرشح المناسبة لتصور Hoechst ، اليكسا-555 ، و اليكسا-488 مطلوب لهذا البروتوكول. وقد تم تصوير النتائج التمثيلية المبينة في الشكل 1 باستخدام المجهر البؤري الضوئي بالليزر. وينبغي ان المجاهر المسح بالليزر مماثله إنتاج صور قابله للمقارنة. هذا البروتوكول محدود بقدرته علي الكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه فقط وليس ، علي سبيل المثال ، الفطريات. مجسات محدده الفطرية 18S أو 28S rRNA يجب ان تستخدم لتحديد مسببات الامراض الفطرية داخل الانسجه18.
وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول الحفاظ علي بيئة معقمه طوال العملية وضمان ان الانسجه لا تجف بين التهجين وتلطيخ الخطوات. إذا كان النسيج يجف اثناء العملية ، قد تكون الاشاره مبلله أو قد يسقط النسيج من الشريحة اثناء خطوه الغسيل. كما انه من المهم دائما استخدام قسمين تسلسليين لهذا البروتوكول-أحدهما لمسبار rRNA 16S والاخر لمسبار التدافع. بدون هذه السيطرة ، قد يكون من الصعب جدا التمييز بين الإيجابيات الزائفة والبيانات التي تم الحصول عليها قد لا تكون مفيده أو غنيه بالمعلومات. إذا تم تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع مسبار آخر غير المسبار العالمي لل rRNA 16S ، يجب توخي الحذر لاختيار درجه حرارة التهجين المناسبة ، تقريبا 5 درجه مئوية اقل من ذوبان درجه الحرارة المتوقعة من المسبار. للحفاظ علي كثافة الاشاره ، يجب ان لا يتعرض النسيج للضوء لفترات طويلة من الزمن بعد ان تمت أضافه المسبار ويجب الا يتعرض لفرط العرض اثناء المجهر. أخيرا, اثناء مجهريه الضبط نفسه للقناه يماثل إلى ال [فلوفيبور] مترافق إلى السمكة تحقيق ينبغي كنت أبقيت متسقة بين التجريبية ([16 س] [ررنا] تحقيق) وتحكم (يتبارى تحقيق) منزلقات. يعتبر تصور العلاقة المكانية للبكتيريا داخل الأسطح المخاطية للانسجه المستمدة من المريض أمرا بالغ الاهميه لفهم وبناء فرضيات ذات صله سريريا حول تفاعلات المضيف-الممرض الكامنة وراء الامراض المعدية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود ان نشكر كيم أورث ومارزا دي سوزا سانتوس علي المشورة المتعلقة بالمراسم وأماندا اريوت للحصول علي الدعم الفني. وكان هذا العمل مدعوما جزئيا من قبل سيسيل h. وأيدا الأخضر كرسي في علوم علم الاحياء النظم التي عقدتها ك
Materials
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
| Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
| Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
| Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
| Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
| Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
| 0.22 micron syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |
References
- Abraham, S. N., Miao, Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).
- Wolfe, A. J., et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).
- Grist, M., Chakraborty, J. Identification of a mucin layer in the urinary bladder. Urology. 44 (1), 26-33 (1994).
- Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. Uroplakins in urothelial biology, function, and disease. Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).
- Ingersoll, M. A., Albert, M. L. From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa. Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).
- Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria. Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).
- Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), (2013).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women. Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).
- De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. , (2019).
- Amann, R. I., et al. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).
- Vaishnava, S., et al. The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine. Science. 334 (6053), 255-258 (2011).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
- Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures. Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Ludwig, W., et al. ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).
- Jaziri, F., et al. PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification. Database (Oxford). , (2014).
