JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

İnsan Dışkı Örneklerinde Campylobacter Jejuni'nin Ulaşım Medyasında Tespit ve Sağkalım Sınırını Belirlemek Için Kültür Yöntemleri

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/60457
, ,
1TECHLAB, Inc.

Summary

Campylobacter için dışkı kültürü kesin olmasa da, hala kimlik için altın standart olarak kabul edilir. C. jejuni’nin insan dışkısındaki nakil medyasında tespit ve sağkalım sınırını belirleme yöntemleri tanımlanmış ve daha doğru bir şekilde yeni bir immünoassay ile karşılaştırılmaktadır.

Abstract

Campylobactertabanlı bağırsak hastalığı tanısı için insan dışkı bir kültür birkaç gün sürer, bir bekleyin bu vergi hekim ve hastanın metanet. Bir kültür de örnek işleme sırasında canlılık rasgele kaybı, diğer dışkı florasının aşırı büyüme ve geleneksel medya üzerinde çeşitli patojenik Campylobacter türlerin in kötü büyüme yanlış negatif sonuçlareğilimli. Bu sorunlar hasta tedavisi ile ilgili klinik kararları şaşırtmak ve Campylobacter büyüme ve enfeksiyonlar hakkında temel sorulara cevap alan sınırlı dır. Bir kültür tarafından tespit edilebilen bakteri sayılarının alt sınırını tahmin eden bir prosedür ve bu kırılgan organizmanın taşınması nda kullanılan ortamda C. jejuni’nin sağkalımını ölçmek için bir yöntem tanımladık. Bu bilgileri bilerek, tanısal testler için klinik olarak ilgili algılama eşikleri belirlemek ve semptomatik olmayan kolonizasyonun yaygın olup olmadığı, diğer enterik patojenlerle birlikte enfeksiyon yaygın olup olmadığı veya bakteriyel yükün semptomlar veya ciddi sekellerle ilişkili olup olmadığı gibi incelenmemiş sorunları ele almak mümkün olur. Çalışma da başlangıçta konvansiyonel kültür tarafından sınıflandırılan ve daha yeni bir enzim immünoassay tarafından test edildi 1.552 prospektif olarak toplanan hasta ishal dışkı örneklerinin test dahil. Pozitif ve ayrık örnekler daha sonra gerçek-pozitif veya doğru-negatif durum atamak için dört moleküler yöntemle tarandı. Kültür dışı 5 yöntem, 48 pozitif ve ayrık numunenin tümü üzerinde tam bir anlaşma gösterirken, kültür 14’ünü (%28) yanlış tanımlamıştır. Kültür tarafından yanlış tanımlanan örnekler arasında 13 yanlış negatif ve 1 yanlış pozitif örnek yer al›rıldı. Bu temel protokol birden fazla Campylobacter spp ile kullanılabilir ve insanlarda gastroenterit belirtileri üreten Campylobacter bakteri sayısıbelirlenecek ve yaygınlık oranları güncellenmesi için izin verecektir.

Introduction

Amerika Birleşik Devletleri Hastalık Kontrol Merkezleri (CDC) son zamanlarda Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) gözetim programı 2018 yılında laboratuvar tanısı Campylobacter enfeksiyonları9.723 vaka bildirdi yayınladı1. Bu, 2015−2017 1’deki Campylobacter vaka raporlarında%12’likbir artışı temsil eder. Dünya çapında, Campylobacter spp. en sık bakteriyel bağırsakenfeksiyonlarıarasında 2 . Bununla birlikte, her yıl meydana gelen Campylobactertabanlı bağırsak hastalıklarının sayısı3underreported olduğundan şüpheleniliyor. Çoğu hasta sadece orta rahatsızlık ve hiçbir tıbbi tedavi ile kurtarabilirsiniz, çünkü bu küçümseme tahmin edilebilir. Ancak, daha ciddi semptomları olan veya ciddi hastalık için daha yüksek risk altında olan ve daha sonra tıbbi bakım arayan hastalar için, dışkı kültürü Campylobacter onların sıkıntı neden olan patojen olup olmadığını değerlendirmek için en yaygın yöntemdir4.

Campylobacter spp için, dışkı kültürü özellikle zahmetli. En sık görülen patojenik organizmalar, C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis, ve C. lari, mikroaofilik5. Bu bakteri bir kez havaya maruz rasgele, bilinmeyen oranlarda ölecek anlamına gelir. Böylece numune toplama ve kültür kurulumu arasındaki zaman, kültüre göre uygulanabilir Campylobacter spp.’yi tespit etme yeteneğinde kontrolsüz bir değişken haline gelir.

Dışkı örneklerinin doğrudan kültürü için Campylobacter’ın yavaş büyümesi de bir sorundur. Campylobacter kolonileri kuluçka 48 saat sonra bile çok küçük ve kolayca dışkı matris rakip organizmalar tarafından kaplanabilir. C. jejuni ve C. coli en suşları dirençli olan antibiyotik içeren plakalar yaygın olarak kullanılır, antibiyotikler birçok büyümesini inhibe olarak (ama hepsi değil) rakip dışkı bakterilerinin, Campylobacter kolonilerin daha iyi görselleştirilmesine izin6. Ancak, C. lari ve C. upsaliensis gibi diğer Campylobacter türleri bu antibiyotiklerin bazılarına duyarlıdır, ve ya kötü ya da hiç büyümek. Bu bu antibiyotiğe duyarlıtürler campylobacter enfeksiyonların underreporting katkıda 7 .

Campylobacter için bir kültürün yanlış olmasının üçüncü bir nedeni vardır. Bakteri, stresli, canlı kalabilir ama “non-culturable”8olabilir. Bu tanım, kültürün örnekte bulunan bakterileri tespit edeceği anlamına gelir. Bunun ne sıklıkta oluştuğu bilinmemektedir8.

Kültür ile bu potansiyel sorunlar göz önüne alındığında, hatalı kültür sonuçları tek bir karşılaştırıcı taht yanlış 9 görünmesi vermedi, böylece birden fazla karşılaştırma başvuru yöntemlerikullanılır. Kullanılan kültür yöntemleri (örneğin, Campylobacter-seçici plakalar, taşıma ortamı, gaz üreten poşetler) dışkı numune sikültürü için klinik laboratuvarlarda yaygın olarak kullanıldığından seçilmiştir10.

Burada açıklanan kültür protokolleri, insan dışkısında kültür tarafından tespit edilebilen en düşük Campylobacter jejuni sayısı bilinmeden geliştirildi. Kümes hayvanı dışkısı11’debulunan koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayısı için tahminler yayınlanmış olsa da, campylobacter spp. tavuklarda kommensal olduğu ve ishale neden olmadığı için bu sonuçlar insan dışkısına eşit olamaz. Bu temel bilgi insanlarda gastroenterit belirtileri üretecek Campylobacter bakteri sayısını belirlemek ve suşları veya türler arasında virülans karşılaştırmak için gereklidir.

Protocol

1. Contrived İnsan Dışkı Örneklericampylobacter Numaralandırma NOT: Tüm adımlar steril teknik ve malzemeler dezenfekte laminar akış güvenlik kaputu içinde tek kullanımlık koruyucu levha üzerinde yapılır. DİkKAT: Canlı Campylobacter bulaşıcı dır ve ishal de dahil olmak üzere hastalığa neden olabilir. Bakterileri kullanırken eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü takın. Ağız pipet etmeyin. Bakterilerle temas eden tüm maddeleri uygun biyolojik tehlike kaplarında atın. Bakterilerin stok kültürünün büyümesi C. jejuni (ATCC-33560) veya C. coli (ATCC 33559)(Malzeme Tablosu)suşlarını kurutulmuş veya dondurulmuş kültürler olarak elde edin ve üreticinin talimatlarına göre bakterileri rehydrate veya eritin. Rehydrated bakterileri campylobacter-spesifikagar plakasına koyve kültürü başlatın. Mikroaerobik atmosfer gaz üreten poşet içeren anaerobik bir kavanozda 37 °C’de plaka48 h kuluçka. Ertesi gün, beyin-kalp infüzyonu 100 mL hazırlamak (BHI) büyüme suyu içeren 0.5% triptikal, 0.5% proteaz pepton, 0.0125% sodyum pirüuvat, ve 0.0125% sodyum bisülfit. Önceden gevşek şişe kapsayan ve bir mikroaeroofilik ortam üretecek bir poşet ile anaerobik bir kavanoza yerleştirerek BHI suyu azaltmak. Suyu bir gecede 37 °C’de önceden azaltın. Benzer şekilde, 1.1.10 ve 1.2.2 adımlarında koloni sayımları için kullanılacak Campylobacter-spesifikplakaları önceden küçültün. Campylobacter havaya duyarlı olduğundan, et suyu aşılamadan önce tüm malzemeleri toplamak ve kültürleri işleme sırasında aylaklık etmeyin. Aşılamaya hazır olduğunuzda, fetal büyükbaş serumu (FBS) toplam hacmin %4’üne kadar azaltılmış et suyuna ekleyin. 600 nm (OD600)optik yoğunluk ölçümlerinde boş olarak hizmet vermek için önceden küçültülmüş et suyu 1 mL koruyun. FBS içeren önceden azaltılmış suyu 3 mL çıkarın ve Campylobacter kültürünü içeren başlangıç plakası kazımak için et suyu kullanın. Plakayı bir aşı halkası ile hafifçe kazıyın ve bakteriyel bulamacı steril bir tüpe aktarın. 100 mL önceden küçültülmüş suyu yaklaşık 3 mL bakteriyel bulamaç ile aşılayın ve gaz üreten poşet içeren bir anaerobik kavanozda 37 °C’de 115 rpm’de orta sallayarak inkübatör. OD600’debakteri spektrofotometrik olarak bulanıklık la büyümesini izleyin. Ayrılmış suyu boş olarak kullanın. Anaerobik kavanoz açılırsa, gaz üreten poşeti değiştirin. 48−72 h’den veya OD600 değeri ~0,4’e ulaşmadan önce et suyu kuluçkasını durdurun.NOT: Bu OD600 genellikle 107-10 8 CFU/mL eşittir. Tipik sonuçlar için Tablo 1’e bakın. Saf stok kültüründe bakteri sayısını belirlemek için, 900 μL seyreltme tamponu(Malzeme Tablosu)içinde 100 μL’lik 8 adet 10 kat seyreltme serisi gerçekleştirin. 100 μL’lik et suyu ilk seyreltme için çıkarıldıktan sonra, şişeyi taze gaz üreten poşetle anaerobik kavanoza geri döndürün. 10-5 ila 10-7 seyreltmelerin 100 μL’sini, 1.1.3 adımdan çoğaltılmış önceden indirgenmiş Campylobacter-spesifikplakalara yaymak için steril kaplama boncukları kullanın. Kullanılan seyreltme li etiket plakaları, gaz üreten poşetli ikinci bir anaerobik kavanoza koyun ve 37 °C’de 48−72 saat kuluçkaya yatırın.NOT: Seyreltme şeması ve kolonifotoğrafları için Şekil 1 ve Şekil 2’ye bakınız. Büyümeden sonra, saymak için 30−300 koloniler arasında plaka seçin. Denklem 1’i kullanarak stok suyu kültürünün CFU/mL’sini belirlemek için sayımları yararlanın:Stoktaki CFU/mL = Seçilen (yinelenen) analitik plakalar üzerindeki kolonilerin ortalama #ı ÷ (mL kaplamalı x plakaseyreltme) [Denklem 1] Contrived klinik dışkı örneklerinin hazırlanması ve numaralandırması Analitik sayımlar için plakalar adım 1.1.10’da hazırlandıktan hemen sonra, stok suyu ve Campylobacter-negatif dışkı havuzundan (NFP) 10 seri 2 kat seyreltme ler hazırlayarak ikinci bir stok suyu seyreltme seti yapın. Örneğin, eşit hacimlerde et suyu ve NFP’yi (örn. 0,1 mL) karıştırarak ilk seyreltmeyi hazırlayın ve belirlenen bir et suyu ve NFP karışımını eşit belirlenmiş hacimli NFP ile bir tüpe aktararak sonraki seyreltmeleri yapın. Olmayan Campylobacter kolonileri belirlemeye yardımcı olmak için dışkı havuzuna eklenen hiçbir Campylobacter içeren et suyu ile bir kontrol plakası ekleyin. NFP’yi daha önce test edilmiş ve Campylobacterenzim immünoassay ve 16S rRNA qPCR gibi yöntemlerle negatif olarak test edilmiş, ishal edilen hasta gözetim örneklerinden veya sağlıklı donör dışkılarından yapın. T-streak 10 μL her Campylobacter/ dışkı seyreltme çoğaltılmış önceden indirgenmiş Campylobacter-özel agar plakaları üzerinde. Plakaları gaz üreten bir poşetle anaerobik kavanoza yerleştirin ve 37 °C’de 48 ± 2 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Saf Campylobacter kültürlerinden benzer koloniler için çizgili plakaları görsel olarak inceleyin.NOT: Üçüncü çeyrek genellikle bunların bulunacağı yerdir. Seyreltme şeması ve koloni boyutu, renk ve morfolojigörüntüleri için Şekil 1 ve Şekil 2’ye bakınız. Koloniler ve Gram lekesi gibi birden fazla Campylobacterseçin. Bir yağ daldırma lens ile mikroskopi kullanarak, gram-negatif kavisli, spiral veya puro şeklinde küçük bakteriler için ince çizgili bir alan incelemek.NOT: Campylobacter Gram-negatif ve bir karşı leke olarak temel fuşin gerektirir (tipik safranin yerine) doğru görselleştirilmesi için. Klasik martı kanatlı bakteriler görülebilir ama bir gereklilik değildir. Temsili mikrograf için Şekil 2’ye bakınız. Belirli bir seyreltme de yinelenen plakalar biri 1 veya daha fazla Campylobacter kolonileri mevcut varsa, bu seyreltme dışkı kültürü olumlu düşünün. Görünür bir Campylobacteriçeren son seyreltme düşünün -gram-negatif koloni gibi kültür algılama sınırı. Kontrived klinik dışkı örneğinde pozitif seyreltmenin CFU/mL’sini hesaplamak için Denklem 2’yi kullanın:Dışkı örneğinde CFU/mL = Analitik CFU/mL ÷ Son pozitif koloni ile seyreltme [Denklem 2]NOT: Tipik sonuçlar için Tablo 2’ye bakınız. 2. Ulaşım Medyasında Depolanan Campylobacter’in Canlılık Tayini Mix 1 mL Campylobacter et suyu kültürü (adım 1.1.8) NFP 1 mL ile ve NFP 10 yinelenen iki kat seri seyreltme hazırlamak. Her seyreltme daha fazla seyreltmek için Cary-Blair medyasında 1:4 ilave, tıpkı taşıma medyasında hazırlanan bir klinik numunenin tedavi edilmesi gibi. Cary-Blair ortamlarında 20 seyreltme tüpünü ve negatif kontrolü 2−8 °C’de 96 saat boyunca saklayın ve sıfır zamanda ve her 24 saatte bir meydana gelen her seyreltme kolonisini depolayın. Koloni sayma için, her seyreltme koloni sayma için et suyu örnek: dışkı tüpleri ve kurulum dışkı kültürü, yinelenen. Her gün 1.1.9−1.2.7 adımlarında açıklandığı gibi, Campylobacter-selektif agar ve kuluçka 37 °C’de dışkı seyreltmelerinin 10 μL porsiyonlarını 48 saat boyunca tamamlayın. Yukarıda açıklandığı gibi orijinal bakteri stokunun (adım 1.1.8 veya taze olarak yetiştirilen bir et suyu stokundan) eşzamanlı analitik plaka sayımıyapın (adım 1.1.9−1.1.11) gerçekleştirin. Orijinal bakteri stokunun CFU/mL’sini(Denklem 1)hesaplayın ve taşıma ortamı dışkı örneğindeki bakterilerin konsantrasyonunu ve seyreltmelerini hesaplayın(Denklem 2). 3. Kültür Dışı Kültür Sonuçlarının Doğrulanması Nasiması En az yanlış pozitif sonuçlar12 veren bir enzim immünoassay (EIA) kullanın ve kültür sonuçlarını doğrulamak için paket ekleme talimatlarına göre gerçekleştirin. Campylobacter türlerinin geniş bir yelpazede 16S rRNA geni veya diğer gen tespit edebilirsiniz moleküler bir titre kullanabilirsiniz13. Moleküler testin C. upsaliensis veya C. lari gibi standart antibiyotik içeren agar14’tekötü büyüyen türlerle reaksiyona girer olduğunu doğrulayın. Dışkı örneklerinden DNA çıkarma ve testi gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına uyun.NOT: 16S amplicon çift yönlü DNA sıralaması olumlu bir örnek campylobacter türünü doğrulamak için kullanılabilir. Türlere özgü PCR (hedef genler için Tablo 3’e bakınız) ayrık veya pozitif örneklerde bulunan türleri tanımlamak için de kullanılabilir15.

Representative Results

Rakip dışkı florası arasında Campylobacter spp. kolonilerin belirlenmesi keskin görme ve önemli bir yargı gerektirir. Kültür tarafından tespit edilebilen en düşük koloni sayısı incelenmemekle birlikte, hastalardan alınan örneklerin 106−109 CFU/mL16,17olduğu tahmin edilmektedir. Ancak doğru bakteri sayılarını belirlemek için bağımsız bir yöntem olmadığı için hasta örnekleri nicel olarak kullanılamaz. Bu sınırlamayı aşmak için, bir bakteri stoku ile iki eşzamanlı ölçüm yapılır. Bir test, campylobacter kolonilerinin fekal matriksteki stok bakterilerin seri seyreltmelerinden görsel olarak saptanması nda kullanılır, klinik numuneleri simüle eder; diğeri ise spiking için kullanılan bakteri stok kültüründe bulunan CFU/mL’yi ölçmek için analitik olarak kullanılır (Şekil 2A). Campylobacter için algılama eşikleri tanımlı değerler olmayacaktır. Her dışkı matris karmaşık ve benzersiz ve bakterilerin büyüme değişken olduğu için bu beklenebilir. Başarı için önemli bir parametre rakip dışkı florası arasında kesin boyut kolonileri belirlenmesidir. Çivili dışkı kültürünün temsili bir plakası Şekil 2C ve Şekil 2D’degösterilmiştir. Campylobacter olmadan negatif kontrol plakası diğer dışkı florası belirlemeye yardımcı olmak için önemlidir. Gram boyama birçok aday da doğru parlak koloniler ve fuşin lekeli gram-negatif bakterilerin ara pembe renk ayırt etmek için göz trenler ve seçilen kolonilerde bakterilerin morfolojisi doğrular(Şekil 2B). 5 C. jejuni ve 2 C. coli suyu kullanılarak yedi bağımsız deney yapıldı ve 0.3−5 x 106 CFU/mL’den çakışan eşikler verildi. Tipik veriler için Tablo 2’ye bakın. Algılama limitleri C. jejuni için ortalama 2 x 106 ve C. coliiçin 1.2 x 106 CFU/mL. Bu kültür büyük olasılıkla standart antibiyotik içeren Campylobacterüzerinde dışkı numunegram başına ~ 1−2 x 106C. jejuni veya C. coli tespit edebilirsiniz gösterir -birçok klinik laboratuvarları tarafından kullanılan özel agar. Koloni tespiti için farklı eşikler verebilir farklı antibiyotikler ile birden fazla özel agar vardır. Burada açıklanan yöntemler, kültürün doğruluğunu artırmak ve yeni medyanın çok yönlülüğünü genişletmek için daha nicel ve karşılaştırmalı çalışmaları teşvik etmelidir. Örneğin, ilk 10-5 plakada 152 koloni, ikinci10-5 plakada 144 koloni sayılmıştır. İki tabaka arasındaki ortalama 148 kolonidir. Plakalar 0.1 mL (100 μL) 10-5 seyreltme ile aşılanmıştır, bu da Denklem 1 ile saf kültür stoğunda 148 x 106 (14,8 x 107) CFU/mL’ye eşittir. Dışkı seyreltmeleri yapıldığında, kültür 1:1 oranında negatif dışkı havuzuna çivilendi. Bu nedenle, Denklem 2ile dışkı eğrisindeki ilk nokta (“a” levhası) 14,8 x 107’ye karşılık gelir ve 7,4 x 107 CFU/mL’ye eşittir. Bu “a” tüp 9 ek seyreltme yapmak için kullanılır. Şekil 1’de Campylobacterile görünür bir gram-negatif koloni ile son seyreltme -morfoloji si “g” plakası üzerindedir. Bu örnekte algılama dışkı kültür eşiği için 1.1 x 106 CFU/mL eşittir. Sürdürülebilir canlılık kültürün doğruluğunun anahtarı olsa da, hastaların tedavi ve referans laboratuvarlarına numunelerin sevkiyatı sırasında Campylobacter spp.’nin canlılığının korunması sorunludur. Tipik depolama hava maruz ilerlik ve özel bir atmosfer ile sıradan kapaklı tüpler örnekleri soğutmak için. Taşıma medyasındaki örneklerin (korunmuş numuneler olarak da bilinir) daha iyi sağkalım alabildiği düşünülmektedir, ancak nicel veri sağlayan birkaç rapor vardır18. Yukarıda gösterilen analitik ve contrived örneklem yöntemlerinin birleşimi, taşıma medyasında C. jejuni’nin canlılık ve hayatta kalma süresi tahminlerini elde etmek için tekrar kullanılmıştır. Bir bakteriyel stok suyu dışkı matris 1024 kat örnek seyreltme on iki kat hazırlamak için kullanılmıştır. İlk et suyu analitik sayımlar tarafından 4.8 x 107 CFU/mL konsantrasyonuna sahip bulundu. 0. günde yapılan plakalarda C. jejuni tespit edildi (2 gün sonra) 1.5 x 106 CFU/mL’ye eşdeğer 32 kat seyreltme ile plaka üzerinde çizgili plaka üzerinde. Ancak, Cary Blair dışkı örneğinin 24 saat soğutulmasından sonra yapılan plakalarda, sadece 2 kat seyreltme (2,4 x 107 CFU/mL’ye eşdeğer) görünür koloniler büyüdü. Çalışma durdurulduğunda 96 saate kadar başka canlılık kaybı görülmedi. Bu canlılık kaybı 16 kat () eşittir az 24 saat içinde culturable organizmaların kaybı ve daha az 107 CFU / mL C. jejuni ile Cary Blair orta soğutma bile dışkı kültür tarafından cevapsız olabilir gösterir. Kültür sonuçlarının aksine, ÇED ilk zaman noktasında ve 4 günlük test süresi boyunca 256 kat seyreltme de C. jejuni varlığını tespit etti. Çivili dışkı örnekleri kullanılarak bu ÇED için C. jejuni algılama eşiği 8.4 x 104 CFU/mL’dir. Bu eşik dışkı kültürünün altındadır ve C. jejunidaha hassas ve istikrarlı tespiti sağlar. Kültürün Campylobacter spp.’yi gerçek bir klinik ortamda tespit etme yeteneğini test etmek için, 1.552 klinik dışkı örneği 6 işlemle karakterize edildi: dışkı kültürü, Campylobacter spp., ve 4 moleküler yöntem için yeni bir immünoassay. Tüm numuneler prospektif olarak toplandı ve başlangıçta Amerika Birleşik Devletleri’ndeki 3 laboratuvarda konvansiyonel kültüre göre sınıflandırıldı ve daha sonra ÇED tarafından çapraz kontrol edildi. Herhangi bir kültür-pozitif veya ÇED / kültür-discrepant örnekleri daha sonra moleküler yöntemlerle taranmış12. Örneklere kültür dışı 5 yöntemin sonuçlarına göre doğru-pozitif veya doğru-negatif durum atandı. Kültür dışı 5 yöntem, 48 pozitif ve ayrık numunenin tümü üzerinde tam bir anlaşma gösterirken, kültür 14’ünü () yanlış tanımlamıştır. Kültür tarafından yanlış tanımlanan örnekler arasında 13 yanlış negatif ve 1 yanlış pozitif örnek yer al›rıldı. Şekil 1: Analitik ve çivili dışkı örneklerinin eşzamanlı hazırlanması için şema. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Saf ve dışkı kültürlerinden C. jejuni kolonilerinin belirlenmesi. (A) 72 saat kuluçka dan sonra saf bakteri kültüründen C. jejuni kolonileri fotoğrafı. (B) Saf bakteri kültüründen C. jejuni gram leke, yağ daldırma 400x büyütme. (C) Fotoğraf C. jejuni-pozitif sivri dışkı kültürü sonra 48 h kuluçka. (D) Kutu içinde genişlemiş alan (C), 10x büyütme. Beyaz oklar pin noktası boyutu gram-negatif C. jejuni kolonileri gösterir. Siyah ok ucu biraz daha büyük bir koloni gösterir, gram-pozitif, ve C. jejunideğil . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Kültür OD600 @ T0 OD600 @ T Final1 Son CFU/mL C. jejuni 0.146 0.321 1,28 x 107 C. coli 0.245 0.508 4,50 x 108 Tablo 1: C. jejuni ve C. coli stoklarının tipik büyüme ve CFU/mL’si. 1C. jejuni kültürü kuluçka 48 saat sonra durduruldu. C. coli kültürü 54 saat kuluçkadan sonra durduruldu. Çivili dışkı numunesi için seyreltme tüpü Campylobactersayısı -koloniler gibi Gram-negatif kolonisayısı1 Kültür olumlu mu? Çivili numunenin hesaplanan CFU/mL’si C. jejuni (1,28 x 108 CFU/mL hisse senedi) (2 kat) bir Yoğun nd2 Evet 6,40 x 107 (4 kat) b 20+ Nd Evet 3,20 x 107 (8 kat) c 4-10 Nd Evet 1,60 x 107 (16 kat) d Nd Evet 8,00 x 106 (32 kat) e Nd Evet 4,00 x 106 (64 kat) f 1-3 2’nin 1’i Evet 2,00 x 106 (128 kat) g 3’te 2 Evet 1,00 x 106 3(256 kat) h 2’nin 1’i Evet 5,00 x 105 (512 kat) i 0 / 1 № 2,50 x 105 (1024 kat) j 0 Nd № Nfp C. coli (4,50 x 108 CFU/mL stok) (2 kat) bir Yoğun Nd Evet 2,25 x 108 (4 kat) b Nd Evet 1,13 x 108 (8 kat) c 50+ Nd Evet 5,63 x 107 (16 kat) d 30+ Nd Evet 2,81 x 107 (32 kat) e 10+ Nd Evet 1,41 x 107 (64 kat) f 3-8 Nd Evet 7,03 x 106 (128 kat) g Nd Evet 3,52 x 106 3(256 kat) h 1-3 3’te 1 Evet 1,76 x 106 (512 kat) i 0 / 1 № 8,79 x 105 (1024 kat) j 0 Nd № Nfp Tablo 2: Çivili dışkı örneklerinin plakaları üzerindeki tipik koloni sayıları. Campylobacterarasında 1 Gram negatif koloniler -koloniler gibi, 2nd = belirlenmemiş, kalın tipte 3veri son pozitif seyreltme gösterir. Tür Gen hedefi C. jejuni hipO C. coli cadF C. upsaliensis cpn60 C. lari cpn60 C. helveticus cpn60 C. fetüs cpn60 C. hyointestinalis cpn60 C. concisus cpn60 Tablo 3: Genler bireysel Campylobacter türlerinin saptanması için yararlıdır qPCR.

Discussion

Burada açıklanan kültür yöntemleri basit, yaygın olarak kullanılan teknikler ve malzemelerin çoğulaboratuvar10mevcuttur üzerine inşa edilmiştir. Dışkı kültürleri için klinik olarak ilgili bir algılama eşiği hakkında yeni bilgiler sağlayan analitik ve contrived örneklerin birleşimidir. Ayrıca, 5 ayrı tahlil ile kültür sonuçlarının karara Campylobacter dışkı kültürünün hasta örneklerinin önemli bir bölümünü yanlış tanımladığı vardığı sonuçları güçlendirir. ÇED ve moleküler tahliller kontrol ler olarak yararlıdır, çünkü her biri farklı bir ilkeye (antikor ve DNA amplifikasyonu ile antijen etkileşimi) dayanır ve daha da önemlisi bakterilerin canlılığına güvenmez. Bu çalışmalar da kullanılan EIA tahliliyi iyi doğrulanmış olduğunu ve 4 moleküler test12ile tam olarak aynı fikirde olduğu gösterilmiştir unutmayın.

Campylobacter spp. Kültürü özellikle zahmetli, duyarlılık 60−76%19,20arasında değişen rapor ve burada gerçek-pozitif örnekleri tespit etmek için başarısızlık onun ~ 30% oranı belirgin. Personel, kültür verileri negatif olduğunda, eia kontrolü ve moleküler testlerin sık lıkla olumlu sonuçlar doğuracağını bekleyebilir.

Protokoldeki en kritik adım, rakip dışkı florası arasında pin noktası kolonilerinin belirlenmesidir. Algılama eşiğine yakın seyreltmeler olarak, alternatif sıfır ve sıfır olmayan koloni sayısı tahminlerine (örneğin, 2, 0, 1, 0, 0) sahip olmak olağandışı değildir. Kültür eşiklerinin belirli bir CFU/mL değil, bir dizi konsantrasyon olacağını kabul etmek önemlidir. Yine de, kültür tespiti için bir alt sınır olarak ~ 1 x 106 CFU / mL dışkı tahmini enfekte insanlar gram dışkı21başına 106 ila 109Campylobacter döken raporları ile iyi karşılaştırır . Antibiyotikler veya agar plakaları ve varyasyonları bireysel dışkı örneklerikaçınılmaz değişiklikler şüphesiz eşik değerleri değişecektir. Bu protokol, büyüme medyasında iyileştirmelere olanak sağlamalıdır.

Kültür algılama için bir sınır bu ilk bilgi mümkün tanı testleri için klinik olarak ilgili eşikleri ayarlamak için yapar, ve non-semptomatik taşıma incelenmemiş sorunları ele almak için gerekli olan mikrobiyolojik temel koyar22, Campylobactertarafından23 , ya da bakteriyel yük belirtileri veya ciddi sekel ile ilişkili ise.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmalar TECHLAB, Inc. tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Anaerobic 3.5L Jar Thermo Fisher HP0031A
AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar Hardy Diagnostics AG701
Bacto Brain Heart Infusion BD Biosciences 237500
Bacto Protease Peptone Life Technologies Corp 211684
Basic Fuchsin Fisher Scientific B12544
BBL Trypticase Peptone Life Technologies Corp 211921
C. coli Type strain ATCC 33559
C. jejuni Type strain ATCC 33560
CampyGen gas generating system sachet Thermo Fisher CN0025A
Campylobacter QUIK CHEK TechLab, Inc. T5047 / T31025
Cary-Blair transport medium Fisher Scientific 23-005-47
Coli Roller Sterile plating beads Millipore Sigma 71013
Dilution Buffer Anaerobe Systems AS-908
Fetal bovine serum Equitech-Bio, Inc SFBM30
Sodium bisulfite Sigma-Aldrich 243973
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Spectrophotometer cuvettes USA Scientific 9090-0460
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. . Annual Summaries of Foodborne Outbreaks Available from: https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html (2018)
  2. Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. Global Epidemiology of Campylobacter Infection. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 687-720 (2015).
  3. Pitkanen, T. a., H, M. L., Rose, J. B., Jimenez-Cisneros, B. . Global Water Pathogen Project. , (2017).
  4. Fitzgerald, C., et al. Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool. Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1209-1215 (2016).
  5. Kirkpatrick, B. D., Tribble, D. R. Update on human Campylobacter jejuni infections. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (1), 1-7 (2011).
  6. CDC. Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2013. Morbidity and Mortality Weekly Report. 63, 328-332 (2014).
  7. Jaime, A. L., et al. Campylobacter upsaliensis: Another Pathogen for Consideration in the United States. Clinical Infectious Diseases. 34 (11), 59-60 (2002).
  8. Bullman, S., O’Leary, J., Corcoran, D., Sleator, R., Lucey, B. Molecular-based detection of non-culturable and emerging campylobacteria in patients preseting with gastroenteritis. Epidemiology and Infection. 140, 684-688 (2012).
  9. Giltner, C. L., Saeki, S., Bobenchik, A. M., Humphries, R. M. Rapid Detection of Campylobacter Antigen by Enzyme Immunoassay Leads to Increased Positivity Rates. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 618-620 (2013).
  10. M’ikanatha, N. M., et al. Culturing stool specimens for Campylobacter spp., Pennsylvania, USA. Emerging Infectious Disease. 18, 484-487 (2012).
  11. Al Amri, A., Senok, A. C., Ismaeel, A. Y., Al-Mahmeed, A. E., Botta, G. A. Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools. Journal of Medical Microbiology. 56 (10), 1350-1355 (2007).
  12. Buss, J. E., et al. Campylobacter culture fails to correctly detect Campylobacter in 30% of positive patient stool specimens compared to non-cultural methods. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38, 1087-1093 (2019).
  13. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  14. Couturier, B. A., Hale, D. C., Couturier, M. R. Association of Campylobacter upsaliensis with Persistent Bloody Diarrhea. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3792-3794 (2012).
  15. Chaban, B., Musil, K. M., Himsworth, C. G., Hill, A. K. Development of cpn60-Based Real-Time Quantitative PCR Assays for the Detection of 14 Campylobacter Species and Application to Screening of Canine Fecal Samples. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3055-3061 (2009).
  16. Allos, B., Blaser, M. J., Mandell, G. L., Bennett, J. E., Dolin, R. . Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed. , 2793-2802 (2009).
  17. Anderson, N. W., Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Comparison of the BD MAX Enteric Bacterial Panel to Routine Culture Methods for Detection of Campylobacter, Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157), Salmonella, and Shigella Isolates in Preserved Stool Specimens. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1222-1224 (2014).
  18. Wasfy, M., Oyofo, B., Elgindy, A., Churilla, A. Comparison of preservation media for storage of stool samples. Journal of Clinical Microbiology. 33 (8), 2176-2178 (1995).
  19. Bessède, E., Delcamp, A., Sifre, E., Buissonniere, A., Mégraud, F. New Methods for Detection of Campylobacters in Stool Samples in Comparison to Culture. Journal of Clinical Microbiology. 49 (3), 941-944 (2011).
  20. Bessède, E., et al. Evaluation of the Diagnostic Accuracy of Two Immunochromatographic Tests Detecting Campylobacter in Stools and Their Role in Campylobacter Infection Diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), (2018).
  21. Shane, A. L., et al. Infectious Diseases Society of America Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea. Clinical Infectious Diseases. 65 (12), 1963-1973 (2017).
  22. Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Astudillo, X., Fernández, H. Occurrence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter species isolated from healthy children attending municipal care centers in Southern Ecuador. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 59, 77-77 (2017).
  23. Lee, G., et al. Symptomatic and asymptomatic Campylobacter infections associated with reduced growth in Peruvian children. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (1), 2036 (2013).

Tags

Campylobacter JejuniCultureDetectionSurvivalTransport MediaFecal SpecimensLimit Of DetectionAnaerobicMicroaerobicOptical DensityDilution SeriesPlate Counting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Buss, J. E., Thacker, E., Santiago, M. Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens. J. Vis. Exp. (157), e60457, doi:10.3791/60457 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image