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Immunology and Infection

Méthodes de culture pour déterminer la limite de détection et de survie dans les médias de transport de Campylobacter Jejuni dans les spécimens fécals humains

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/60457
, ,
1TECHLAB, Inc.

Summary

Bien que la culture des selles pour Campylobacter soit imprécise, elle est toujours considérée comme l’étalon-or pour l’identification. Les méthodes pour déterminer la limite de détection et de survie dans les médias de transport de C. jejuni dans les selles humaines sont décrites et comparées à une nouvelle immunoassay avec une meilleure précision.

Abstract

Une culture des selles humaines pour le diagnostic de la maladie intestinale basée sur Campylobacterprend plusieurs jours, une attente qui taxe le courage du médecin et du patient. Une culture est également sujette à de faux résultats négatifs de la perte aléatoire de viabilité lors de la manipulation des spécimens, de la prolifération d’autres espèces fécales et de la faible croissance de plusieurs espèces pathogènes campylobacter sur les médias traditionnels. Ces problèmes peuvent confondre les décisions cliniques sur le traitement des patients et ont limité le domaine de répondre à des questions fondamentales sur la croissance campylobacter et les infections. Nous décrivons une procédure qui estime la limite inférieure des nombres bactériens qui peuvent être détectés par une culture et une méthode pour quantifier la survie de C. jejuni dans les médias utilisés pour le transport de cet organisme fragile. Connaissant cette information, il devient possible d’établir des seuils de détection cliniquement pertinents pour les tests diagnostiques et de traiter les questions non étudiées de savoir si la colonisation non symptomatique est répandue, si la co-infection avec d’autres agents pathogènes entériques est commune, ou si la charge bactérienne est corrélée avec des symptômes ou des séquelles graves. L’étude a également inclus l’essai de 1.552 spécimens fécaux diarrhéiques de patient prospectivement rassemblés qui ont été initialement classifiés par la culture conventionnelle et davantage examinés par une nouvelle immunoassay d’enzyme. Les spécimens positifs et disrepants ont ensuite été examinés par quatre méthodes moléculaires pour attribuer un statut vrai-positif ou vrai négatif. Les 5 méthodes non culturelles ont montré un accord complet sur les 48 spécimens positifs et disrepants, tandis que la culture a mal identifié 14 (28 %). Les spécimens qui ont été incorrectement identifiés par la culture comprenaient 13 faux négatifs et 1 faux échantillon positif. Ce protocole de base peut être utilisé avec plusieurs campylobacter spp. et permettra de déterminer le nombre de bactéries Campylobacter qui produisent des symptômes de gastro-entérite chez l’homme et de mettre à jour les taux de prévalence.

Introduction

Les Centers for Disease Control (CDC) des États-Unis ont récemment publié que le programme de surveillance du Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) a signalé 9 723 cas d’infections à campylobacter diagnostiquées en laboratoire en 20181. Cela représente une augmentation de 12 % des rapports de cas Campylobacter par rapport à 2015-20171. Dans le monde entier, Campylobacter spp. sont parmi les infections intestinales bactériennes les plus courantes2. Néanmoins, le nombre de maladies intestinales à base de Campylobacterqui se produisent chaque année sont soupçonnés d’être sous-déclarés3. Cette sous-estimation est prévisible parce que la plupart des patients peuvent récupérer avec seulement un inconfort modéré et aucun traitement médical. Cependant, pour les patients présentant des symptômes plus graves ou qui sont plus à risque pour la maladie grave, et qui cherchent alors des soins médicaux, la culture des selles est la méthode la plus courante pour évaluer si Campylobacter est l’agent pathogène qui cause leur détresse4.

Pour Campylobacter spp., la culture des selles est particulièrement gênante. Les organismes pathogènes les plus courants, C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis, et C. lari, sont microaérophiles5. Cela signifie que les bactéries mourront à des taux aléatoires et inconnus une fois exposées à l’air. Le temps entre la collecte de spécimens et la configuration de la culture devient ainsi une variable incontrôlée dans la capacité de détecter viable Campylobacter spp. par culture.

Pour la culture directe des spécimens fécaux, la croissance lente de Campylobacter est également un problème. Les colonies de campylobacter sont très petites même après 48 h d’incubation et peuvent facilement être couvertes par des organismes concurrents dans la matrice fécale. Les plaques qui contiennent des antibiotiques auxquels la plupart des souches de C. jejuni et C. coli sont résistantes sont largement utilisées, car les antibiotiques inhibent la croissance de nombreuses bactéries fécales concurrentes (mais pas toutes), permettant une meilleure visualisation des colonies de Campylobacter 6. Cependant, d’autres espèces de Campylobacter comme C. lari et C. upsaliensis sont sensibles à certains de ces antibiotiques, et poussent mal ou pas du tout. Cela contribue à la sous-déclaration des infections Campylobacter de ces espèces sensibles aux antibiotiques7.

Il y a une troisième raison pour laquelle une culture pour Campylobacter peut être inexacte. La bactérie, lorsqu’elle est stressée, peut rester viable, mais peut devenir “non-culturable”8. Cela signifie par définition que la culture ne détectera pas les bactéries présentes dans l’échantillon. La fréquence à laquelle cela se produit n’est pas connue8.

Compte tenu de ces problèmes potentiels avec la culture, nous avons utilisé plusieurs méthodes de référence de comparaison de sorte que les résultats de la culture défectueuse n’a pas fait un seul essai comparateur semblent inexacts9. Les méthodes de culture utilisées (p. ex., Campylobacter-plaques sélectives, moyen de transport, sachets générateurs de gaz) ont été choisies parce qu’elles sont largement utilisées dans les laboratoires cliniques pour la culture des spécimens de selles10.

Les protocoles de culture décrits ici ont été développés parce que le plus petit nombre de Campylobacter jejuni qui pourraient être détectés par la culture dans les selles humaines n’était pas connu. Bien que des estimations aient été publiées pour le nombre d’unités de formation de colonies (CFU) présentes dans les excréments de volaille11, ces résultats ne peuvent pas être assimilés aux selles humaines, car les campylobacter spp. sont des proportionnels chez les poulets et ne causent pas la diarrhée. Cette information fondamentale est nécessaire pour établir le nombre de bactéries Campylobacter qui produiront des symptômes de gastro-entérite chez l’homme et pour comparer la virulence entre les souches ou les espèces.

Protocol

1. Énumération de Campylobacter dans les spécimens fécals humains artificiels REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à l’aide d’une technique stérile et de matériaux sur une feuille de protection jetable dans un capot désinfecté de sécurité du flux laminé. CAUTION : Les campylobacter vivants sont infectieux et peuvent causer des maladies, y compris la diarrhée. Portez des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité chaque fois que vous manipulez des bactéries. Ne pas bouche pipet. Disposer de tout le matériel qui a contacté les bactéries dans des contenants biorisques appropriés. Croissance de la culture stock des bactéries Obtenez des souches de C. jejuni (ATCC-33560) ou C. coli (ATCC 33559)(Tableau des matériaux)en tant que cultures séchées ou congelées et réhydrater ou dégeler les bactéries selon les instructions du fabricant. Sillonne les bactéries réhydratées sur une plaque d’agar spécifique Campylobacterpour démarrer la culture. Incuber la plaque 48 h à 37 oC dans un bocal anaérobie contenant un sachet microaérobie générateur de gaz. Le lendemain, préparer 100 ml de bouillon de croissance d’infusion de cerveau-cœur (BHI) contenant 0,5 % de trypticase, 0,5 % de peptone de protéase, 0,0125 % de pyruvate de sodium et 0,0125 % de bisulfite de sodium. Préréduisent le bouillon BHI en couvrant le flacon lâchement et en le plaçant dans un bocal anaérobie avec un sachet qui produira un environnement microaérophile. Laisser le bouillon préréduquer toute la nuit à 37 oC. De même, préreduisent campylobacter-plaques spécifiques à utiliser pour le nombre de colonies dans les étapes 1.1.10 et 1.2.2. Comme Campylobacter sont sensibles à l’air, rassembler tous les matériaux avant d’inoculer le bouillon et ne pas traîner tout en manipulant les cultures. Lorsqu’il est prêt à inoculer, ajouter le sérum bovin fœtal (FBS) au bouillon préréculé à 4 % du volume total. Conserver 1 mL de bouillon préréducteur pour servir de blanc dans les mesures de densité optique à 600 nm (OD600). Retirer 3 ml de bouillon préréculé contenant du FBS et utiliser le bouillon pour gratter la plaque de démarrage contenant la culture Campylobacter. Gratter délicatement la plaque avec une boucle d’inoculation, puis transférer la boue bactérienne dans un tube stérile. Inoculer les 100 ml de bouillon préréduit avec environ 3 ml de boue bactérienne et incuber avec des secousses modérées à 115 tr/min à 37 oC dans un bocal anaérobie contenant un sachet générateur de gaz. Surveiller la croissance des bactéries spectrophotométriquement par turbidité àOD 600. Utilisez le bouillon réservé comme un blanc. Si le pot anaérobie est ouvert, remplacez le sachet générateur de gaz. Arrêter l’incubation du bouillon après 48-72 h ou avant que la valeur OD600 atteigne 0,4.REMARQUE : Ce600 OD équivaut généralement à 107 à 108 CFU/mL. Voir le tableau 1 pour obtenir des résultats typiques. Pour établir le nombre de bactéries dans la culture des stocks purs, effectuez huit séries de dilution de 10 fois de 100 l de bouillon dans 900 L de tampon de dilution(Tableau des matériaux). Après que les 100 L de bouillon ont été enlevés pour la première dilution, retournez le flacon dans un bocal anaérobie avec du sachet frais générateur de gaz pour attendre d’être utilisé dans la piscine fécale piquante. Utilisez des perles de placage stériles pour étaler 100 L des dilutions de 10 à10 à10 -7 sur des plaques spécifiques au Campylobacterpréréduquées en double de l’étape 1.1.3. Étiqueter les plaques avec dilution utilisée, les placer dans un deuxième bocal anaérobie avec du sachet générateur de gaz, et incuber à 37 oC pour 48-72 h.REMARQUE : Voir la figure 1 et la figure 2 pour le régime de dilution et les photographies des colonies. Après la croissance, choisissez la plaque avec entre 30 et 300 colonies à compter. Utilisez les comptes pour déterminer le CFU/mL de la culture du bouillon de stock à l’aide de l’équation 1 :CFU/mL en stock – Moyenne des colonies sur les plaques analytiques choisies (dupliquées) – (mL plaqué x dilution de la plaque) [Equation 1] Préparation et énumération des spécimens fécals cliniques artificiels Immédiatement après que les plaques pour les dénombrements analytiques sont préparées dans l’étape 1.1.10, faire une deuxième série de dilutions de bouillon de stock en préparant 10 dilutions série 2 fois du bouillon de stock et un Pool fécal Campylobacter-négatif(NFP). Préparer, par exemple, la première dilution en mélangeant des volumes égaux de bouillon et de PFN (p. ex., 0,1 ml chacun) et faire des dilutions subséquentes en transférant un volume désigné de bouillon et de mélange de NFP dans un tube à volume égal désigné NFP. Ajouter une plaque de commande avec un bouillon contenant aucun Campylobacter ajouté à la piscine fécale pour aider à identifier les colonies nonCampylobacter. Faites le NFP à partir de spécimens de surveillance des patients diarrhéiques déconsequeurs ou de selles de donneurs en bonne santé qui ont déjà été testés et qui se sont avérés être Campylobacter-négatifspar des méthodes telles qu’une immunoassay enzymatique Campylobacter et par 16S rRNA qPCR. T-streak 10 ‘L de chaque dilution Campylobacter/stool sur des plaques d’agars préréduisantes en double. Placer les plaques dans le bocal anaérobie avec un sachet générateur de gaz et incuber à 37 oC pendant 48 à 2 h. Examinez visuellement les plaques strié pour les colonies ressemblant à celles des cultures campylobacter pures.REMARQUE : Le troisième quadrant est généralement l’endroit où ceux-ci seront trouvés. Voir la figure 1 et la figure 2 pour le schéma de dilution et les images de la taille, de la couleur et de la morphologie des colonies. Sélectionnez plusieurs colonies de Campylobacteret gram. À l’aide d’une microscopie à l’aide d’une lentille d’immersion à l’huile, examinez une zone finement strié pour les petites bactéries courbes, spirales ou en forme de cigare.REMARQUE : Les campylobacter sont Gram-négatifs et exigent le fuchsin de base comme comptoir (au lieu de la safranine typique) pour être visualisé avec précision. Des bactéries classiques à ailes de mouette peuvent être observées, mais ne sont pas une exigence. Voir la figure 2 pour le micrographe représentatif. Si l’une ou l’autre des plaques en double à une dilution spécifique a 1 ou plus campylobacter colonies présentes, considérez que la dilution fécal-culture positive. Considérez la dernière dilution qui contient une colonie visible Campylobacter-commegram-négatif la limite de détection de la culture. Utilisez l’équation 2 pour calculer l’AMC/ML de la dilution positive chez le spécimen fécal clinique artificiel :CFU/mL dans l’échantillon fécal – Analyse CFU/mL – Dilution avec la dernière colonie positive [Equation 2]REMARQUE : Voir le tableau 2 pour obtenir des résultats typiques. 2. Détermination de la viabilité du Campylobacter stocké dans les médias de transport Mélanger 1 ml de culture de bouillon campylobacter (étape 1.1.8) avec 1 mL de NFP et préparer 10 doubles dilutions en série dans NFP. Diluer davantage chaque dilution un supplément de 1:4 dans les médias Cary-Blair, tout comme un spécimen clinique préparé dans les médias de transport est traité. Conservez les 20 tubes de dilution et un contrôle négatif dans le milieu Cary-Blair dans des tubes plafonnés à 2 à 8 oC pour 96 h et comptez les colonies de chaque dilution se produisant à un moment zéro et tous les 24 h. Pour le comptage des colonies, goûtez le bouillon : tubes fécaux et configuration de la culture fécale pour le comptage des colonies de chaque dilution, en double. Chaque jour, plaque 10 portions de lil des dilutions fécales sur l’agar sélectif Campylobacteret incubate à 37 oC pour 48 h, comme décrit ci-dessus dans les étapes 1.1.9-1.2.7. Effectuez un compte de plaque analytique simultané du stock bactérien d’origine (à partir de l’étape 1.1.8 ou d’un bouillon fraîchement cultivé) tel que décrit ci-dessus (étapes 1.1.1.1.1.11). Calculer le CFU/mL du stock bactérien d’origine(Équation 1) pour calculer la concentration de bactéries dans l’échantillon fécal des médias de transport et ses dilutions (Equation 2). 3. Essais non culturels pour vérifier les résultats de la culture Utilisez une immunoassay enzymatique (EIA) qui donne un minimum de faux résultats positifs12 et effectuer selon les instructions d’insertion de paquet pour vérifier les résultats de la culture. Utilisez un essai moléculaire qui peut détecter le gène 16S rRNA ou un autre gène d’un large éventail d’espèces Campylobacter 13. Confirmez que l’essai moléculaire réagit avec des espèces comme C. upsaliensis ou C. lari qui poussent mal sur l’agar antibiotique standardcontenant 14. Suivez les instructions du fabricant pour l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons fécaux et l’exécution du test.REMARQUE : Le séquençage bidirectionnel de l’ADN de l’amplicon 16S peut être employé pour confirmer l’espèce de Campylobacter dans un spécimen positif. Le PCR spécifique aux espèces (voir le tableau 3 pour les gènes cibles) peut également être utilisé pour identifier les espèces présentes dans les spécimens disrepants ou positifs15.

Representative Results

Identifier Campylobacter spp. colonies parmi la flore fécale concurrente exige une vue vive et un jugement considérable. Le plus faible nombre de colonies qui peuvent être détectées par la culture n’a pas été étudié, bien que les spécimens de patients aient été estimés à 106à 109 CFU/mL16,17. Cependant, les échantillons de patients ne peuvent pas être utilisés quantitativement car il n’existe pas de méthode indépendante pour établir des nombres bactériens précis. Pour surmonter cette limitation, deux mesures simultanées sont effectuées avec un stock bactérien. Un test est utilisé pour la détection visuelle des colonies de Campylobacter à partir de dilutions sérieuses des bactéries du stock dans une matrice fécale, simulant des spécimens cliniques; l’autre est utilisé analytiquement pour quantifier l’AMC/ML présent dans la culture des stocks bactériens utilisée pour le picage(figure 2A). Les seuils de détection de Campylobacter ne seront pas définis. Cela est à prévoir parce que chaque matrice fécale est complexe et unique, et la croissance des bactéries est variable. Un paramètre clé pour le succès est d’identifier les colonies de taille précise parmi la flore fécale concurrente. Une plaque représentative de la culture des selles à pointes est indiquée dans la figure 2C et la figure 2D. La plaque de contrôle négative sans Campylobacter ajouté est important pour aider à identifier d’autres flore fécales. Gram colorant de nombreux candidats forme également l’œil pour distinguer les colonies brillantes correctes et la couleur rose intermédiaire des bactéries gram-négatives tachées de fuchsin et confirme la morphologie des bactéries dans les colonies sélectionnées(figure 2B). Sept expériences indépendantes ont été réalisées, à l’aide de 5 bouillons C. jejuni et 2 C. coli, et ont donné des seuils qui se chevauchaient et s’étendaient de 0,3 à 5 x 106 CFU/mL. Voir le tableau 2 pour obtenir des données typiques. Les limites de détection étaient en moyenne de 2 x 106 pour C. jejuni et de 1,2 x 106 CFU/mL pour C. coli. Cela indique que la culture peut probablement détecter 1 à 2 x 106C. jejuni ou C. coli par gramme de spécimen fécaux sur l’agar spécifique à l’antibiotique standard de Campylobacterutilisé par de nombreux laboratoires cliniques. Il existe plusieurs agars spécialisés avec différents antibiotiques qui peuvent donner des seuils différents pour la détection des colonies. Les méthodes décrites ici devraient encourager davantage d’études quantitatives et comparatives afin d’améliorer l’exactitude de la culture et d’élargir la polyvalence des nouveaux médias. Par exemple, 152 colonies ont été comptées sur la première plaque de10 à 5 et 144 colonies sur la deuxième plaque de 10à 5. La moyenne entre les deux plaques est de 148 colonies. Les plaques ont été inoculées avec 0,1 ml (100 lL) de 10-5 dilution, qui par l’équation 1 équivaut à 148 x 106 (14,8 x 107) CFU/mL dans le stock de culture pure. Lorsque les dilutions fécales ont été faites, la culture a été poussée dans la piscine fécale négative à un rapport de 1:1. Par conséquent, par l’équation 2, le premier point (plaque “a”) sur la courbe fécale correspond à 14,8 x 107 divisé par 2 et équivaut à 7,4 x 107 CFU/mL. Ce tube “a” est utilisé pour faire 9 dilutions supplémentaires. Dans la figure 1, la dernière dilution avec une colonie gramme-négative visible avec Campylobacter-commela morphologie est sur la plaque “g”. Cela équivaut à 1,1 x 106 CFU/mL pour le seuil de détection de la culture fécale dans cet exemple. Même si la viabilité soutenue est essentielle à l’exactitude de la culture, la conservation de la viabilité de Campylobacter spp. pendant la manipulation et l’expédition de spécimens des patients aux cliniques aux laboratoires de référence est problématique. L’entreposage typique consiste à réfrigérer des spécimens dans des tubes plafonnés ordinaires avec exposition à l’air et sans atmosphère particulière. On pense que les spécimens dans les médias de transport (aussi appelés échantillons conservés) ont une meilleure survie, mais il y a peu de rapports qui fournissent des données quantitatives18. La combinaison des méthodes analytiques et artificielles de l’échantillon montrée ci-dessus a été utilisée à nouveau pour obtenir des estimations de temps de survie et de survie de C. jejuni dans les médias de transport. Un bouillon de stock bactérien a été utilisé pour préparer dix doubles dilutions d’échantillon de 2 fois à 1024 fois dans la matrice fécale. Le bouillon initial a été trouvé par les comptes analytiques pour avoir une concentration de 4.8 x 107 CFU/mL. Sur les plaques fabriquées le jour 0, C. jejuni a été détecté (2 jours plus tard) sur la plaque strié avec la dilution 32 fois, équivalente à 1,5 x 106 CFU/mL. Cependant, sur les plaques faites après avoir réfrigéré l’échantillon fécal de Cary Blair pendant 24 heures, seule la dilution à deux reprises (équivalente à 2,4 x 107 CFU/mL) a cultivé des colonies visibles. Aucune autre perte de viabilité n’a été constatée à 96 heures, lorsque l’étude a été arrêtée. Cette perte de viabilité équivaut à une fois de 16 fois (94 %) perte d’organismes culturables en moins de 24 heures et indique que, même avec la réfrigération, les selles dans cary Blair moyen avec moins de10 7 CFU / mL C. jejuni peuvent être manqués par la culture. Contrairement aux résultats de la culture, l’EIA a détecté la présence de C. jejuni à la dilution 256 fois au point de temps initial et tout au long de la période d’essai de 4 jours. Le seuil de détection C. jejuni pour cette EIE à l’aide d’échantillons fécaux à pointes est de 8,4 x 104 CFU/mL. Ce seuil est inférieur à celui de la culture fécale et permet une détection plus sensible et plus stable de C. jejuni. Pour tester la capacité de la culture à détecter campylobacter spp. dans un cadre clinique réel, 1 552 échantillons cliniques de selles ont été caractérisés par 6 procédures : la culture fécale, une nouvelle immunoassay pour Campylobacter spp., et 4 méthodes moléculaires. Tous les échantillons ont été recueillis de façon prospective et initialement classés par la culture conventionnelle dans 3 laboratoires aux États-Unis, puis contre-vérifiés par l’EIA. Tous les spécimens de culture positive ou EIA/culture-discrepant ont ensuite été examinés par les méthodes moléculaires12. Les spécimens ont été attribués un statut vrai-positif ou vrai-négatif basé sur les résultats des 5 méthodes non-culture. Les 5 méthodes non culturelles ont montré un accord complet sur les 48 spécimens positifs et disrepants, tandis que la culture a mal identifié 14 (28 %). Les spécimens qui ont été incorrectement identifiés par la culture comprenaient 13 faux négatifs et 1 faux échantillon positif. Figure 1 : Régime de préparation simultanée d’échantillons fécaux analytiques et à pointes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Identification des colonies de C. jejuni provenant de cultures pures et fécales. (A) Photographie des colonies de C. jejuni de la culture bactérienne pure après 72 heures d’incubation. (B) Tache de gramme de C. jejuni de la culture bactérienne pure, l’immersion d’huile 400x grossissement. (C) Photographie de C. jejuni-positive à pointes de culture fécale après 48 h incubation. (D) Zone agrandie dans la boîte dans (C), grossissement 10x. Les flèches blanches indiquent la taille de pin-point gram-négatif C. jejuni colonies. La pointe de flèche noire indique une colonie légèrement plus grande, gram-positive, et non C. jejuni. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Cultures OD600 @ T0 OD600 – T Finale1 Finale CFU/mL C. Jejuni 0.146 0.321 1,28 x 107 C. coli 0.245 0.508 4,50 x 108 Tableau 1 : Croissance typique et CFU/mL des stocks de C. jejuni et de C. coli. 1La culturede C. jejuni a été arrêtée après 48 h d’incubation. La culture de C. coli a été arrêtée après 54 h d’incubation. Tube de dilution pour l’échantillon fécal à pointes Nombre de colonies de Campylobacter-comme Nombre de colonies Gram-négatives1 Culture positive ? CFU/mL calculé de l’échantillon à pointes C. jejuni (1,28 x 108 CFU/mL stock) (2 fois) un Dense nd2 Oui 6,40 x 107 (4 fois) b 20 ans et plus Nd Oui 3.20 x 107 (8 fois) c 4-10 Nd Oui 1,60 x 107 (16 fois) d Nd Oui 8,00 x 106 (32 fois) e Nd Oui 4.00 x 106 (64 fois) f 1-3 1 sur 2 Oui 2,00 x 106 (128 fois) g 2 sur 3 Oui 1,00 x 106 3(256 fois) h 1 sur 2 Oui 5,00 x 105 (512 fois) i 0 sur 1 non 2,50 x 105 (1024 fois) j 0 Nd non Pfn C. coli (4,50 x 108 CFU/mL stock) (2 fois) un Dense Nd Oui 2,25 x 108 (4 fois) b Nd Oui 1.13 x 108 (8 fois) c 50 ans et plus Nd Oui 5,63 x 107 (16 fois) d 30 ans et plus Nd Oui 2,81 x 107 (32 fois) e 10 ans et plus Nd Oui 1,41 x 107 (64 fois) f 3-8 Nd Oui 7.03 x 106 (128 fois) g Nd Oui 3,52 x 106 3(256 fois) h 1-3 1 sur 3 Oui 1,76 x 106 (512 fois) i 0 sur 1 non 8,79 x 105 (1024 fois) j 0 Nd non Pfn Tableau 2 : Nombre typique de colonies sur des plaques d’échantillons fécaux à pointes. 1 Les colonies négatives de gramme parmi les colonies de Campylobacter-comme, 2nd – non déterminées, 3Les données en caractères gras indiquent la dernière dilution positive. Espèces Cible génétique C. Jejuni hipO C. coli cadF (en) C. upsaliensis cpn60 C. lari cpn60 C. helveticus cpn60 C. foetus cpn60 C. hyointestinalis cpn60 C. concisus cpn60 Tableau 3 : Gènes utiles pour la détection des espèces individuelles de Campylobacter qPCR.

Discussion

Les méthodes de culture décrites ici sont construites sur des techniques et des matériaux simples et largement utilisés disponibles dans la plupart des laboratoires10. C’est la combinaison d’échantillons analytiques et artificiels qui fournissent de nouvelles informations d’un seuil de détection cliniquement pertinent pour les cultures fécales. De plus, l’arbitrage des résultats de la culture avec 5 essais distincts renforce les conclusions selon lesquelles la culture fécale campylobacter identifie mal une partie importante des spécimens de patients. L’EIA et les essais moléculaires sont utiles comme contrôles parce qu’ils sont chacun basé sur un principe différent (interaction antigène avec l’amplification des anticorps vs ADN) et, surtout, ne reposent pas sur la viabilité des bactéries. Notez que l’analyse de l’EIA utilisée pour ces études est bien validée et s’est avérée entièrement d’accord avec 4 tests moléculaires12.

La culture de Campylobacter spp. est particulièrement gênante, avec une sensibilité rapportée pour varier de 60-76%19,20, et comme en témoigne son taux de 30% de défaut de détecter les spécimens vrais positifs ici. Le personnel peut s’attendre à ce que le contrôle de l’EIE et des tests moléculaires produise fréquemment des résultats positifs lorsque les données sur la culture sont négatives.

L’étape la plus critique du protocole est l’identification des colonies de points d’épingle entre la flore fécale concurrente. Il n’est pas rare, comme les dilutions près du seuil de détection, d’avoir des estimations de nombre de colonies nulles et non nulles (p. ex., 2, 0, 1, 0, 0). Il est important de reconnaître que les seuils de culture seront une gamme de concentrations, et non une CFU/ML spécifique. Néanmoins, l’estimation de 1 x 106 excréments CFU/mL comme limite inférieure pour la détection de la culture se compare bien aux rapports selon lesquels les humains infectés ont perdu 106 à 109Campylobacter par gramme d’excréments21. Les changements dans les antibiotiques ou les plaques d’agar et les variations inévitables dans les spécimens fécaux individuels changeront sans aucun doute les valeurs de seuil. Ce protocole devrait permettre d’améliorer les médias de croissance.

Cette première information sur une limite pour la détection de la culture permet de fixer des seuils cliniquement pertinents pour les tests diagnostiques, et pose la base microbiologique qui est nécessaire pour répondre aux problèmes non étudiés de la voiture non-symptomatique22,23 par Campylobacter, ou si la charge bactérienne est en corrélation avec des symptômes ou des séquelles graves.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces études ont été financées par TECHLAB, Inc.

Materials

Anaerobic 3.5L Jar Thermo Fisher HP0031A
AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar Hardy Diagnostics AG701
Bacto Brain Heart Infusion BD Biosciences 237500
Bacto Protease Peptone Life Technologies Corp 211684
Basic Fuchsin Fisher Scientific B12544
BBL Trypticase Peptone Life Technologies Corp 211921
C. coli Type strain ATCC 33559
C. jejuni Type strain ATCC 33560
CampyGen gas generating system sachet Thermo Fisher CN0025A
Campylobacter QUIK CHEK TechLab, Inc. T5047 / T31025
Cary-Blair transport medium Fisher Scientific 23-005-47
Coli Roller Sterile plating beads Millipore Sigma 71013
Dilution Buffer Anaerobe Systems AS-908
Fetal bovine serum Equitech-Bio, Inc SFBM30
Sodium bisulfite Sigma-Aldrich 243973
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Spectrophotometer cuvettes USA Scientific 9090-0460
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References

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Buss, J. E., Thacker, E., Santiago, M. Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens. J. Vis. Exp. (157), e60457, doi:10.3791/60457 (2020).
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