JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Cultuurmethoden om de limiet van detectie en overleving in transportmedia van Campylobacter Jejuni in menselijke fecale specimens te bepalen

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/60457
, ,
1TECHLAB, Inc.

Summary

Hoewel de ontlastingscultuur voor Campylobacter onnauwkeurig is, wordt het nog steeds beschouwd als de gouden standaard voor identificatie. Methoden om de grens van detectie en overleving in transportmedia van C. jejuni in menselijke ontlasting te bepalen worden beschreven en vergeleken met een nieuwe immunoassay met een betere nauwkeurigheid.

Abstract

Een cultuur van menselijke ontlasting voor de diagnose van Campylobacter-gebaseerdedarmziekte duurt enkele dagen, een wachttijd dat de standvastigheid van de arts en de patiënt belastingen. Een cultuur is ook gevoelig voor valse negatieve resultaten van willekeurig verlies van levensvatbaarheid tijdens het hanteren van specimens, overgroei van andere fecale flora, en slechte groei van verschillende pathogene Campylobacter soorten op traditionele media. Deze problemen kunnen klinische beslissingen over de behandeling van patiënten verwarren en hebben het veld beperkt van het beantwoorden van fundamentele vragen over de groei van Campylobacter en infecties. We beschrijven een procedure die de ondergrens van bacteriële getallen schat die kunnen worden gedetecteerd door een cultuur en een methode voor het kwantificeren van de overleving van C. jejuni in media die worden gebruikt voor het vervoer van dit fragiele organisme. Het kennen van deze informatie, wordt het mogelijk om klinisch relevante detectiedrempels in te stellen voor diagnostische tests en onbestudeerde kwesties aan te pakken van de vraag of niet-symptomatische kolonisatie voorkomt, als co-infectie met andere enterische pathogenen vaak voorkomt, of als bacteriële belasting correleert met symptomen of ernstige sequelae. De studie omvatte ook het testen van 1.552 prospectief verzamelde patiënt diarree fecale exemplaren die aanvankelijk werden geclassificeerd door conventionele cultuur en verder getest door een nieuw enzym immunoassay. Positieve en discrepant specimens werden vervolgens gescreend door vier moleculaire methoden om true-positieve of true-negatieve status toe te wijzen. De 5 niet-cultuurmethoden toonden volledige overeenstemming over alle 48 positieve en discrepant specimens, terwijl de cultuur verkeerd geïdentificeerd 14 (28%). De monsters die ten onrechte werden geïdentificeerd door de cultuur opgenomen 13 valse negatieve en 1 vals-positieve monster. Dit basisprotocol kan worden gebruikt met meerdere Campylobacter spp. en zal het mogelijk maken het aantal Campylobacter bacteriën die symptomen van gastro-enteritis produceren bij de mens te bepalen en voor prevalentie tarieven worden bijgewerkt.

Introduction

De United States Centers for Disease Control (CDC) publiceerde onlangs dat de Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) surveillance programma gemeld 9.723 gevallen van laboratorium-gediagnosticeerde Campylobacter infecties in 20181. Dit is een stijging van 12% in campylobacter-casereports over 2015-20171. Wereldwijd behoren Campylobacter spp. tot de meest voorkomende bacteriële darminfecties2. Niettemin worden het aantal op Campylobactergebaseerde darmziekten die elk jaar optreden, vermoedelijk ondergerapporteerd3. Deze onderschatting is voorspelbaar omdat de meeste patiënten kunnen herstellen met slechts matig ongemak en geen medische behandeling. Echter, voor patiënten met meer ernstige symptomen of die een hoger risico op ernstige ziekte, en die vervolgens medische zorg zoeken, ontlasting cultuur is de meest voorkomende methode voor de beoordeling of Campylobacter is de ziekteverwekker die hun nood veroorzaakt4.

Voor Campylobacter spp., ontlasting cultuur is bijzonder lastig. De meest voorkomende pathogene organismen, C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis, en C. lari, zijn microaerofiele5. Dit betekent dat de bacteriën zal sterven op willekeurige, onbekende tarieven eenmaal blootgesteld aan lucht. De tijd tussen specimen collectie en cultuur setup wordt dus een ongecontroleerde variabele in de mogelijkheid om levensvatbare Campylobacter spp. detecteren door cultuur.

Voor de directe cultuur van fecale specimens is de langzame groei van Campylobacter ook een probleem. Campylobacter kolonies zijn zeer klein, zelfs na 48 uur van incubatie en kan gemakkelijk worden gedekt door concurrerende organismen in de fecale matrix. Platen die antibiotica bevatten waarop de meeste stammen van C. jejuni en C. coli resistent zijn, worden veel gebruikt, omdat de antibiotica de groei van veel (maar niet alle) concurrerende fecale bacteriën remmen, waardoor een betere visualisatie van Campylobacter kolonies6. Echter, andere Campylobacter soorten zoals C. lari en C. upsaliensis zijn gevoelig voor sommige van deze antibiotica, en ofwel groeien slecht of helemaal niet. Dit draagt bij aan de onderrapportage van Campylobacter infecties van deze antibioticagevoelige soorten7.

Er is een derde reden waarom een cultuur voor Campylobacter onjuist kan zijn. De bacteriën, wanneer benadrukt, kunnen levensvatbaar blijven, maar kan worden “niet-culturable”8. Dit betekent per definitie dat de cultuur de bacteriën in het monster niet detecteert. Hoe vaak dit gebeurt is niet bekend8.

Gezien deze potentiële problemen met cultuur, gebruikten we meerdere vergelijkingreferentiemethoden, zodat foutieve cultuurresultaten geen enkele comparator-test onnauwkeurig lieten lijken9. De gebruikte kweekmethoden (bijvoorbeeld Campylobacter-selectieveplaten, transportmedium, gasgenererende zakjes) werden gekozen omdat ze op grote schaal worden gebruikt in klinische laboratoria voor de kweek vanontlastingsexemplaren 10.

De hier beschreven cultuurprotocollen werden ontwikkeld omdat het laagste aantal Campylobacter jejuni dat door cultuur in menselijke ontlasting kon worden ontdekt niet gekend was. Hoewel schattingen zijn gepubliceerd voor het aantal kolonievormende eenheden (CFU) aanwezig in pluimveeuitwerpselen11, kunnen deze resultaten niet worden gelijkgesteld met menselijke ontlasting, omdat Campylobacter spp. evenredig zijn bij kippen en geen diarree veroorzaken. Deze fundamentele informatie is nodig om het aantal Campylobacter bacteriën die symptomen van gastro-enteritis bij de mens zal produceren vast te stellen en om virulentie tussen stammen of soorten te vergelijken.

Protocol

1. Opsomming van Campylobacter in gekunstelde menselijke fecale specimens OPMERKING: Alle stappen worden uitgevoerd met behulp van steriele techniek en materialen op een wegwerpbeschermkap in een gedesinfecteerde laminaire stroomveiligheidskap. LET OP: Live Campylobacter zijn besmettelijk en kan ziekte veroorzaken, waaronder diarree. Draag handschoenen, een labjas en een veiligheidsbril bij het hanteren van bacteriën. Geen mondpijp. Gooi al het materiaal dat bacteriën heeft gecontacteerd in de juiste biohazard containers. Groei van de voorraadcultuur van bacteriën Verkrijg stammen van C. jejuni (ATCC-33560) of C. coli (ATCC 33559)(Tabel met materialen)als gedroogde of bevroren culturen en hydrateren of ontdooien bacteriën volgens de instructies van de fabrikant. Streep de gehydrateerde bacteriën op een Campylobacter-specifiekeagar plaat om de cultuur te starten. Incubeer de plaat 48 uur bij 37 °C in een anaerobe pot met een microaërobe atmosfeer gasgenererend zakje. Op de volgende dag, bereid 100 mL van de hersenen-hart infusie (BHI) groeibouillon met 0,5% trypticase, 0,5% proteasetoon, 0,0125% natriumpyruvaat, en 0,0125% natriumbisulfiet. Verlaag de BHI-bouillon vooraf door de kolf losjes af te dekken en in een anaerobe pot te plaatsen met een zakje dat een microaerofiele omgeving zal produceren. Laat de bouillon ‘s nachts voorverlagen bij 37 °C. Op dezelfde manier, prereduce Campylobacter-specifiekeplaten worden gebruikt voor kolonie telt in stappen 1.1.10 en 1.2.2. Als Campylobacter zijn gevoelig voor lucht, verzamel alle materialen voor het inenten van bouillon en niet treuzelen tijdens het hanteren van culturen. Wanneer u klaar bent om in te enten, voegt u foetaal runderserum (FBS) toe aan vooraf gereduceerde bouillon tot 4% van het totale volume. Bewaar 1 mL voorgereduceerde bouillon om te dienen als een blanco in metingen van de optische dichtheid op 600 nm (OD600). Verwijder 3 mL voorgereduceerde bouillon met FBS en gebruik bouillon om de startplaat met de Campylobacter-cultuur te schrapen. Schraap de plaat voorzichtig met een inentingslus en breng vervolgens de bacteriële drijfmest over naar een steriele buis. Inenten de 100 mL voorgereduceerde bouillon met ongeveer 3 mL bacteriële drijfmest en incubeer met matig schudden bij 115 tpm bij 37 °C in een anaërobe pot met een gasgenererend zakje. Monitor de groei van de bacteriën spectrofotometrisch door troebelheid op OD600. Gebruik de gereserveerde bouillon als een blanco. Als de anaerobe pot wordt geopend, vervang dan het gasgenererende zakje. Stop de incubatie tijd van bouillon na 48−72 uur of voordat de OD600-waarde ~0,4 bereikt.OPMERKING: Deze OD600 komt meestal overeen met 107 tot 108 CFU/mL. Zie tabel 1 voor typische resultaten. Voer acht 10-voudige verdunningsreeksen van 100 μL bouillon uit in 900 μL verdunningsbuffer (Tabel met materialen). Nadat de 100 μL bouillon voor de eerste verdunning is verwijderd, breng je de kolf terug naar anaerobe pot met vers gasgenererend zakje om te wachten op gebruik in het stealfebad. Gebruik steriele beplatingskralen om 100 μL van de 10-5 tot 10-7 verdunningen te verspreiden op dubbele voorverlaagde Campylobacter-specifiekeplaten uit stap 1.1.3. Etiketplaten met verdunning gebruikt, plaats ze in een tweede anaërobe pot met gasgenererend zakje en broed op 37 °C gedurende 48−72 uur.LET OP: Zie figuur 1 en figuur 2 voor verdunningsschema en foto’s van kolonies. Kies na groei de plaat met tussen de 30−300 kolonies om te tellen. Gebruik de tellingen om de CFU/mL van de bouilloncultuur te bepalen met behulp van vergelijking 1:CFU/mL op voorraad = Gemiddelde # van kolonies op gekozen (dubbele) analytische platen ∙ (mL verguldx verdunning van de plaat) [Vergelijking 1] Bereiding en opsomming van gekunstelde klinische fecale specimens Onmiddellijk nadat de platen voor analytische tellingen zijn bereid in stap 1.1.10, maak een tweede set van voorraad bouillon verdunningen door de voorbereiding van 10 seriële 2-voudige verdunningen uit de bouillon en een Campylobacter-fecale pool (NFP). Bereid bijvoorbeeld de eerste verdunning voor door gelijke hoeveelheden bouillon en NFP (bijvoorbeeld 0,1 mL per stuk) te mengen en latere verdunningen te doen door een aangewezen volume bouillon en NFP-mengsel over te brengen in een buis met een gelijk aangeduid egaliserend nfp. Voeg een controleplaat toe met bouillon die geen Campylobacter bevat die aan het fecale zwembad wordt toegevoegd omniet-Campylobacterkolonies te identificeren. Maak de NFP van gede-identificeerde, diarree patiënt surveillance specimens of gezonde donor ontlasting die eerder zijn getest en gevonden te zijn Campylobacter-negatief door methoden zoals een Campylobacter enzym immunoassay en door 16S rRNA qPCR. T-streak 10 μL van elke Campylobacter/ontlasting verdunning op dubbele voorverlaagde Campylobacter-specifieke agar platen. Plaats platen in de anaerobe pot met een gasgenererend zakje en uitbroed bij 37 °C gedurende 48 ± 2 uur. Bestudeer de gestreepte platen visueel voor kolonies die lijken op die uit pure Campylobacter culturen.OPMERKING: Het derde kwadrant is meestal waar deze zullen worden gevonden. Zie figuur 1 en figuur 2 voor verdunningsschema en afbeeldingen van koloniegrootte, kleur en morfologie. Selecteer meerdere Campylobacter-achtigekolonies en Gram vlek. Met behulp van microscopie met een olie onderdompeling lens, onderzoeken een dun gestreept gebied voor gram-negatieve gebogen, spiraal, of sigaar-vormige kleine bacteriën.OPMERKING: Campylobacter zijn Gram-negatief en vereisen basisfuchsine als tegenvlek (in plaats van de typische safranin) nauwkeurig worden gevisualiseerd. Klassieke meeuw-gevleugelde bacteriën kunnen worden gezien, maar zijn geen vereiste. Zie figuur 2 voor representatieve micrograaf. Als een van de dubbele platen bij een specifieke verdunning 1 of meer Campylobacter kolonies aanwezig heeft, van mening dat verdunning fecale cultuur positief. Overweeg de laatste verdunning die een zichtbare Campylobacter-achtigegram-negatieve kolonie de grens van cultuurdetectie bevat. Gebruik vergelijking 2 om de CFU/mL van de positieve verdunning in gekunstelde klinisch fecale monster te berekenen:CFU/mL in fecale steekproef = Analytische CFU/mL ∙ Verdunning met laatste positieve kolonie [Vergelijking 2]OPMERKING: Zie tabel 2 voor typische resultaten. 2. Levensvatbaarheid Bepaling van Campylobacter opgeslagen in transportmedia Meng 1 mL Campylobacter bouilloncultuur (stap 1.1.8) met 1 mL NFP en bereid 10 dubbele dubbele seriële verdunningen in NFP voor. Verdun elke verdunning verder een extra 1:4 in Cary-Blair media, net zoals een klinisch exemplaar bereid in transportmedia wordt behandeld. Bewaar de 20 verdunningsbuizen en een negatieve controle in cary-Blair medium in afgetopte buizen op 2−8 °C voor 96 uur en tel kolonies van elke verdunning die zich op tijd nul en elke 24 uur. Voor kolonie tellen, monster van de bouillon: fecale buizen en setup fecale cultuur voor kolonie tellen van elke verdunning, in duplicaat. Elke dagplaat 10 μL-delen van de fecale verdunningen op Campylobacter-selectieve agar en uitbroeden bij 37 °C gedurende 48 uur, zoals hierboven beschreven in de stappen 1.1.9−1.2.7. Voer een gelijktijdige analytische plaattelling uit van de oorspronkelijke bacteriële voorraad (vanaf stap 1.1.8 of een vers geteelde bouillonvoorraad) zoals hierboven beschreven (stappen 1.1.9−1.1.11). Bereken de CFU/mL van de oorspronkelijke bacteriële voorraad(Vergelijking 1) om de concentratie van bacteriën in het fecale monster van de transportmedia en de verdunningen ervan(Vergelijking 2)te berekenen. 3. Niet-cultuur testen voor het verifiëren van cultuurresultaten Gebruik een enzym immunoassay (EIA) dat minimale vals-positieve resultatengeeft 12 en uitvoeren volgens instructies voor het invoegen van pakketten om de resultaten van de cultuur te verifiëren. Gebruik een moleculaire test die het 16S rRNA-gen of een ander gen van een breed scala van Campylobacter soorten kan detecteren13. Bevestig dat de moleculaire test reageert met soorten zoals C. upsaliensis of C. lari die slecht groeien op standaard antibiotica-bevattende agar14. Volg de instructies van de fabrikant voor de extractie van DNA uit fecale monsters en het uitvoeren van de test.OPMERKING: Bidirectionele DNA-sequencing van de 16S amplicon kan worden gebruikt om de soorten Campylobacter te bevestigen in een positief exemplaar. Soortspecifieke PCR (zie tabel 3 voor doelgenen) kan ook worden gebruikt om soorten te identificeren die aanwezig zijn in discrepant of positieve specimens15.

Representative Results

Het identificeren van Campylobacter spp. kolonies onder concurrerende fecale flora vereist scherp gezichtsvermogen en een aanzienlijk oordeel. Het laagste aantal kolonies dat door cultuur kan worden gedetecteerd, is niet onderzocht, hoewel specimens van patiënten naar schatting 106−109 CFU/mL16,17. Echter, patiënt monsters kunnen niet kwantitatief worden gebruikt als er geen onafhankelijke methode om nauwkeurige bacteriële nummers vast te stellen. Om deze beperking te overwinnen, worden twee gelijktijdige metingen uitgevoerd met één bacteriële voorraad. Een test wordt gebruikt voor visuele detectie van Campylobacter kolonies van seriële verdunningen van de voorraad bacteriën in een fecale matrix, simuleren van klinische monsters; de andere wordt analytisch gebruikt om de CFU/mL die aanwezig is in de bacteriële voorraadcultuur die wordt gebruikt voor stekelvorming (figuur 2A) te kwantificeren. De detectiedrempels voor Campylobacter worden niet gedefinieerd. Dit is te verwachten omdat elke fecale matrix is complex en uniek, en de groei van bacteriën is variabel. Een belangrijke parameter voor succes is het identificeren van de pinpoint grootte kolonies onder de concurrerende fecale flora. Een representatieve plaat van spiked ontlasting cultuur is weergegeven in figuur 2C en figuur 2D. De negatieve controleplaat zonder toegevoegd Campylobacter is belangrijk om te helpen andere fecale flora te identificeren. Gram kleuring veel kandidaten traint ook het oog om de juiste glanzende kolonies en de tussenliggende roze kleur van fuchsin-gekleurde gram-negatieve bacteriën te onderscheiden en bevestigt de morfologie van de bacteriën in de geselecteerde kolonies (Figuur 2B). Zeven onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd, met behulp van 5 C. jejuni en 2 C. coli bouillons, en gaf drempels die overlapten en overspannen van 0,3−5 x 106 CFU/mL. Zie tabel 2 voor typische gegevens. De detectielimieten bedroegen gemiddeld 2 x 106 voor C. jejuni en 1,2 x 106 CFU/mL voor C. coli. Dit geeft aan dat de cultuur kan waarschijnlijk detecteren ~ 1−2 x 106C. jejuni of C. coli per gram fecale specimen op standaard antibiotica-bevattende Campylobacter-specifieke agar gebruikt door vele klinische laboratoria. Er zijn meerdere gespecialiseerde agars met verschillende antibiotica die verschillende drempels voor koloniedetectie kunnen geven. De hier beschreven methoden moeten meer kwantitatieve en vergelijkende studies aanmoedigen om de nauwkeurigheid van de cultuur te verbeteren en de veelzijdigheid van nieuwe media te verbreden. Zo werden 152 kolonies geteld op de eerste 10-5 plaat en 144 kolonies op de tweede 10-5 plaat. Het gemiddelde tussen de twee platen is 148 kolonies. De platen werden ingeënt met 0,1 mL (100 μL) van 10-5 verdunning, wat volgens vergelijking 1 neerkomt op 148 x 106 (14,8 x 107) CFU/mL in de zuivere kweekvoorraad. Toen de fecale verdunningen werden gemaakt, werd de cultuur spiked in negatieve fecale pool bij een 1:1 verhouding. Daarom komt het eerste punt (plaat “a”) op de fecale curve door vergelijking 2overeen met 14,8 x 107 gedeeld door 2 en is het gelijk aan 7,4 x 107 CFU/mL. Deze “a” buis wordt gebruikt om 9 extra verdunningen te maken. In figuur 1is de laatste verdunning met één zichtbare gram-negatieve kolonie met Campylobacter-achtigemorfologie op plaat “g”. Dit komt neer op 1,1 x 106 CFU/mL voor de fecale kweekdrempel van detectie in dit voorbeeld. Hoewel duurzame levensvatbaarheid de sleutel is tot de nauwkeurigheid van de cultuur, is het behoud van de levensvatbaarheid van Campylobacter spp. tijdens de behandeling en verzending van specimens van patiënten naar klinieken naar referentielaboratoria problematisch. Typische opslag is om specimens te koelen in gewone afgetopte buizen met luchtblootstelling en zonder speciale atmosfeer. Specimens in transportmedia (ook wel bewaarde monsters genoemd) worden verondersteld beter te overleven, maar er zijn weinig rapporten die kwantitatieve gegevens opleveren18. De combinatie van hierboven getoonde analyse- en gekunstelde monstermethoden werd opnieuw gebruikt om de ramingen van C. jejuni in transportmedia levensvatbaar te maken en te overleven. Een bacteriële bouillon werd gebruikt om tien dubbele 2-voudige tot 1024-voudige monsterverdunningen in fecale matrix voor te bereiden. De eerste bouillon werd gevonden door de analytische tellingen om een concentratie van 4.8 x 107 CFU/mL te hebben. Op platen gemaakt op dag 0, C. jejuni werd gedetecteerd (2 dagen later) op de plaat gestreept met de 32-voudige verdunning, gelijk aan 1,5 x 106 CFU/mL. Echter, op de platen gemaakt na het koelen van de Cary Blair fecale monster voor 24 uur, alleen de 2-voudige verdunning (gelijk aan 2,4 x 107 CFU/mL) groeide zichtbare kolonies. Geen verder verlies van levensvatbaarheid werd gezien uit tot 96 uur, toen het onderzoek werd gestopt. Dit verlies van levensvatbaarheid komt overeen met een 16-voudige (94%) verlies van kweekbare organismen in minder dan 24 uur en geeft aan dat, zelfs met koeling, ontlasting in Cary Blair medium met minder dan 107 CFU/mL C. jejuni kan worden gemist door de cultuur. In tegenstelling tot de resultaten van de cultuur, ontdekte de MIA de aanwezigheid van C. jejuni bij de 256-voudige verdunning op het beginmoment en gedurende de testperiode van 4 dagen. De C. jejuni detectiedrempel voor deze m.e.r. met behulp van spiked fecale monsters is 8,4 x 104 CFU/mL. Deze drempel is lager dan die van de fecale cultuur en maakt meer gevoelige en stabiele detectie van C. jejunimogelijk. Om het vermogen van cultuur te testen om Campylobacter spp. in een werkelijke klinische omgeving op te sporen, werden 1.552 klinische ontlastingsmonsters gekenmerkt door 6 procedures: fecale cultuur, een nieuwe immunoassay voor Campylobacter spp., en 4 moleculaire methoden. Alle monsters werden prospectief verzameld en in eerste instantie ingedeeld door conventionele cultuur op 3 laboratoria in de Verenigde Staten, en vervolgens gecontroleerd door m.e.r. Alle cultuurpositieve of EIA/cultuur-discrepant specimens werden vervolgens gescreend door de moleculaire methoden12. Specimens kregen een echt positieve of echt-negatieve status op basis van de resultaten van de 5 niet-cultuurmethoden. De 5 niet-cultuurmethoden toonden volledige overeenstemming over alle 48 positieve en discrepant specimens, terwijl de cultuur verkeerd geïdentificeerd 14 (28%). De monsters die ten onrechte werden geïdentificeerd door de cultuur opgenomen 13 valse negatieve en 1 vals-positieve monster. Figuur 1: Regeling voor gelijktijdige bereiding van analytische en geprikte fecale monsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: Identificatie van C. jejuni kolonies uit zuivere en fecale culturen. (A) Foto van C. jejuni kolonies uit pure bacteriële cultuur na 72 uur incubatie. (B) Gram vlek van C. jejuni uit pure bacteriële cultuur, olie-onderdompeling 400x vergroting. (C) Foto van C. jejuni-positieve spiked fecale cultuur na 48 uur incubatie. (D) Vergroot gebied in vak in (C), 10x vergroting. Witte pijlen geven pin-point grootte gram-negatieve C. jejuni kolonies. De zwarte pijlpunt geeft een kolonie aan die iets groter, gram-positief en niet C. jejuniis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Culturen OD600 @ T0 OD600 @ T Definitief1 Definitieve CFU/mL C. jejuni 0.146 0.321 1,28 x 107 C. coli 0.245 0.508 4,50 x 108 Tabel 1: Typische groei en CFU/mL van C. jejuni en C. coli voorraden. 1C. jejuni cultuur werd gestopt na 48 uur van incubatie. C. coli cultuur werd gestopt na 54 uur incubatie. Verdunningsbuis voor spiked fecale monster Aantal Campylobacter-alskolonies Aantal gramnegatieve kolonies1 Cultuur positief? Berekende CFU/mL van gepiekd monster C. jejuni (1.28 x 108 CFU/mL voorraad) (2-voudig) een Dichte nd2 Ja 6,40 x 107 (4-voudig) b 20+ Nd Ja 3,20 x 107 (8-voudig) c 4-10 Nd Ja 1,60 x 107 (16-voudig) d Nd Ja 8,00 x 106 (32-voudig) e Nd Ja 4,00 x 106 (64-voudig) f 1-3 1 van 2 Ja 2,00 x 106 (128-voudig) g 2 van 3 Ja 1,00 x 106 3(256-voudig) h 1 van 2 Ja 5,00 x 105 (512-voudig) i 0 van 1 № 2,50 x 105 (1024-voudig) j 0 Nd № NFP C. coli (4,50 x 108 CFU/mL-voorraad) (2-voudig) een Dichte Nd Ja 2,25 x 108 (4-voudig) b Nd Ja 1,13 x 108 (8-voudig) c 50+ Nd Ja 5,63 x 107 (16-voudig) d 30+ Nd Ja 2,81 x 107 (32-voudig) e 10+ Nd Ja 1,41 x 107 (64-voudig) f 3-8 Nd Ja 7,03 x 106 (128-voudig) g Nd Ja 3,52 x 106 3(256-voudig) h 1-3 1 van 3 Ja 1,76 x 106 (512-voudig) i 0 van 1 № 8,79 x 105 (1024-voudig) j 0 Nd № NFP Tabel 2: Typische aantallen kolonies op platen van geprikte fecale monsters. 1 Gram negatieve kolonies onder Campylobacter-achtige kolonies, 2nd = niet bepaald, 3Gegevens in vet type geeft laatste positieve verdunning aan. Soort(en) Gendoel C. jejuni Hipo C. coli cadF C. upsaliensis cpn60 C. lari cpn60 C. helveticus cpn60 C. foetus cpn60 C. hyointestinalis cpn60 C. concisus cpn60 Tabel 3: Genen die nuttig zijn voor de detectie van individuele Campylobacter soorten qPCR.

Discussion

De hier beschreven cultuurmethoden zijn gebouwd op eenvoudige, veelgebruikte technieken en materialen die beschikbaar zijn in de meeste laboratoria10. Het is de combinatie van analytische en gekunstelde monsters die nieuwe informatie geven over een klinisch relevante detectiedrempel voor fecale culturen. Bovendien versterkt de uitspraak van cultuurresultaten met 5 afzonderlijke testen de conclusies dat campylobacter fecale cultuur een aanzienlijk deel van de patiëntspecimens verkeerd identificeert. De MER en moleculaire testen zijn nuttig als controles omdat ze elk gebaseerd zijn op een ander principe (antigeen interactie met antilichaam versus DNA-versterking) en, belangrijker nog, niet afhankelijk zijn van levensvatbaarheid van bacteriën. Merk op dat de m.e.r.-test die voor deze studies wordt gebruikt, goed is gevalideerd en waarvan is aangetoond dat deze volledig inovereenstemming is met 4 moleculaire tests12.

Cultuur van Campylobacter spp. is bijzonder lastig, met gevoeligheid gemeld te variëren van 60−76%19,20, en zoals blijkt uit de ~ 30% percentage van het niet op te sporen waar-positieve exemplaren hier. Personeel kan verwachten dat controle-eia en moleculaire tests vaak positieve resultaten zullen opleveren wanneer cultuurgegevens negatief zijn.

De meest kritieke stap in het protocol is de identificatie van pinpuntkolonies tussen concurrerende fecale flora. Het is niet ongebruikelijk, zoals verdunningen in de buurt van de detectiedrempel, om afwisselend nul en niet-nul kolonie telling schattingen (bijvoorbeeld 2, 0, 1, 0, 0). Het is belangrijk te erkennen dat cultuurdrempels een reeks concentraties zullen zijn, niet een specifieke CFU/mL. Niettemin, de schatting van ~ 1 x 106 CFU / mL uitwerpselen als een ondergrens voor cultuurdetectie vergelijkt goed met rapporten dat geïnfecteerde mensen werpen 106 tot 109Campylobacter per gram uitwerpselen21. Veranderingen in antibiotica of agar platen en variaties onvermijdelijk in individuele fecale exemplaren zal ongetwijfeld veranderen drempelwaarden. Dit protocol moet verbeteringen in de groeimedia mogelijk maken.

Deze eerste informatie over een limiet voor cultuurdetectie maakt het mogelijk om klinisch relevante drempels vast te stellen voor diagnostische tests, en legt de microbiologische basis die nodig is om onbestudeerde problemen van niet-symptomatischvervoer22,23 door Campylobacteraan te pakken, of als bacteriële belasting correleert met symptomen of ernstige sequelae.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studies werden gefinancierd door TECHLAB, Inc.

Materials

Anaerobic 3.5L Jar Thermo Fisher HP0031A
AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar Hardy Diagnostics AG701
Bacto Brain Heart Infusion BD Biosciences 237500
Bacto Protease Peptone Life Technologies Corp 211684
Basic Fuchsin Fisher Scientific B12544
BBL Trypticase Peptone Life Technologies Corp 211921
C. coli Type strain ATCC 33559
C. jejuni Type strain ATCC 33560
CampyGen gas generating system sachet Thermo Fisher CN0025A
Campylobacter QUIK CHEK TechLab, Inc. T5047 / T31025
Cary-Blair transport medium Fisher Scientific 23-005-47
Coli Roller Sterile plating beads Millipore Sigma 71013
Dilution Buffer Anaerobe Systems AS-908
Fetal bovine serum Equitech-Bio, Inc SFBM30
Sodium bisulfite Sigma-Aldrich 243973
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Spectrophotometer cuvettes USA Scientific 9090-0460
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. . Annual Summaries of Foodborne Outbreaks Available from: https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html (2018)
  2. Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. Global Epidemiology of Campylobacter Infection. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 687-720 (2015).
  3. Pitkanen, T. a., H, M. L., Rose, J. B., Jimenez-Cisneros, B. . Global Water Pathogen Project. , (2017).
  4. Fitzgerald, C., et al. Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool. Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1209-1215 (2016).
  5. Kirkpatrick, B. D., Tribble, D. R. Update on human Campylobacter jejuni infections. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (1), 1-7 (2011).
  6. CDC. Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2013. Morbidity and Mortality Weekly Report. 63, 328-332 (2014).
  7. Jaime, A. L., et al. Campylobacter upsaliensis: Another Pathogen for Consideration in the United States. Clinical Infectious Diseases. 34 (11), 59-60 (2002).
  8. Bullman, S., O’Leary, J., Corcoran, D., Sleator, R., Lucey, B. Molecular-based detection of non-culturable and emerging campylobacteria in patients preseting with gastroenteritis. Epidemiology and Infection. 140, 684-688 (2012).
  9. Giltner, C. L., Saeki, S., Bobenchik, A. M., Humphries, R. M. Rapid Detection of Campylobacter Antigen by Enzyme Immunoassay Leads to Increased Positivity Rates. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 618-620 (2013).
  10. M’ikanatha, N. M., et al. Culturing stool specimens for Campylobacter spp., Pennsylvania, USA. Emerging Infectious Disease. 18, 484-487 (2012).
  11. Al Amri, A., Senok, A. C., Ismaeel, A. Y., Al-Mahmeed, A. E., Botta, G. A. Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools. Journal of Medical Microbiology. 56 (10), 1350-1355 (2007).
  12. Buss, J. E., et al. Campylobacter culture fails to correctly detect Campylobacter in 30% of positive patient stool specimens compared to non-cultural methods. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38, 1087-1093 (2019).
  13. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  14. Couturier, B. A., Hale, D. C., Couturier, M. R. Association of Campylobacter upsaliensis with Persistent Bloody Diarrhea. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3792-3794 (2012).
  15. Chaban, B., Musil, K. M., Himsworth, C. G., Hill, A. K. Development of cpn60-Based Real-Time Quantitative PCR Assays for the Detection of 14 Campylobacter Species and Application to Screening of Canine Fecal Samples. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3055-3061 (2009).
  16. Allos, B., Blaser, M. J., Mandell, G. L., Bennett, J. E., Dolin, R. . Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed. , 2793-2802 (2009).
  17. Anderson, N. W., Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Comparison of the BD MAX Enteric Bacterial Panel to Routine Culture Methods for Detection of Campylobacter, Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157), Salmonella, and Shigella Isolates in Preserved Stool Specimens. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1222-1224 (2014).
  18. Wasfy, M., Oyofo, B., Elgindy, A., Churilla, A. Comparison of preservation media for storage of stool samples. Journal of Clinical Microbiology. 33 (8), 2176-2178 (1995).
  19. Bessède, E., Delcamp, A., Sifre, E., Buissonniere, A., Mégraud, F. New Methods for Detection of Campylobacters in Stool Samples in Comparison to Culture. Journal of Clinical Microbiology. 49 (3), 941-944 (2011).
  20. Bessède, E., et al. Evaluation of the Diagnostic Accuracy of Two Immunochromatographic Tests Detecting Campylobacter in Stools and Their Role in Campylobacter Infection Diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), (2018).
  21. Shane, A. L., et al. Infectious Diseases Society of America Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea. Clinical Infectious Diseases. 65 (12), 1963-1973 (2017).
  22. Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Astudillo, X., Fernández, H. Occurrence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter species isolated from healthy children attending municipal care centers in Southern Ecuador. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 59, 77-77 (2017).
  23. Lee, G., et al. Symptomatic and asymptomatic Campylobacter infections associated with reduced growth in Peruvian children. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (1), 2036 (2013).

Tags

Campylobacter JejuniCultureDetectionSurvivalTransport MediaFecal SpecimensLimit Of DetectionAnaerobicMicroaerobicOptical DensityDilution SeriesPlate Counting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Buss, J. E., Thacker, E., Santiago, M. Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens. J. Vis. Exp. (157), e60457, doi:10.3791/60457 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image