أساليب الثقافة لتحديد الحد من الكشف والبقاء على قيد الحياة في وسائل الإعلام النقل من Campylobacter Jejuni في عينات البراز البشري
Summary
على الرغم من أن ثقافة البراز لCampylobacter غير دقيقة ، إلا أنها لا تزال تعتبر المعيار الذهبي لتحديد الهوية. يتم وصف طرق تحديد الحد من الكشف والبقاء على قيد الحياة في وسائل الإعلام النقل من C. jejuni في البراز البشري ومقارنتها مع المناعة الجديدة مع دقة أفضل.
Abstract
ثقافة من البراز البشري لتشخيص مرض الأمعاء القائم على Campylobacterيستغرق عدة أيام ، وهو الانتظار الذي يدفع الثبات من الطبيب والمريض. الثقافة هي أيضا عرضة لنتائج سلبية كاذبة من فقدان عشوائي من القدرة على البقاء أثناء التعامل مع العينة، وفرط نمو النباتات البرازية الأخرى، وضعف نمو العديد من الأنواع الكابيلاكت المسببة للأمراض على وسائل الإعلام التقليدية. هذه المشاكل يمكن أن تربك القرارات السريرية بشأن علاج المريض وحدّت من المجال من الإجابة على الأسئلة الأساسية حول نمو كامبيلوباكتر والعدوى. نحن نصف الإجراء الذي يقدر الحد الأدنى من الأرقام البكتيرية التي يمكن الكشف عنها من قبل ثقافة وطريقة لقياس البقاء على قيد الحياة من C. jejuni في وسائل الإعلام المستخدمة لنقل هذا الكائن الحي الهش. مع العلم هذه المعلومات، يصبح من الممكن تعيين عتبات الكشف ذات الصلة سريريا لاختبارات التشخيص ومعالجة القضايا غير المدروسة من ما إذا كان الاستعمار غير أعراض هو السائد، إذا كان المشترك مع العدوى مع مسببات الأمراض المعوية الأخرى هو شائع، أو إذا كان الحمل البكتيري يرتبط مع الأعراض أو عواقب خطيرة. وشملت الدراسة أيضا اختبار 1552 عينات البراز المريض التي تم جمعها في المستقبل التي تم تصنيفها في البداية من قبل الثقافة التقليدية ومواصلة اختبارها من قبل المناعة إنزيم جديد. ثم تم فحص العينات الإيجابية وdiscrepant من قبل أربع طرق جزيئية لتعيين حالة إيجابية حقيقية أو سلبية حقيقية. وأظهرت الأساليب الخمس غير الثقافية اتفاقاً كاملاً على جميع العينات الإيجابية والمنسبة البالغ عددها 48 عينة، في حين أخطأت الثقافة في تحديد 14 عينة (28 في المائة). وشملت العينات التي تم تحديدها بشكل غير صحيح من قبل الثقافة 13 سلبية كاذبة وعينة إيجابية كاذبة واحدة. ويمكن استخدام هذا البروتوكول الأساسي مع العديد من Campylobacter spp. وسوف تسمح لعدد من البكتيريا Campylobacter التي تنتج أعراض التهاب المعدة والأمعاء في البشر ليتم تحديدها ومعدلات الانتشار ليتم تحديثها.
Introduction
نشرت مراكز الولايات المتحدة لمكافحة الأمراض (CDC) مؤخرًا أن برنامج المراقبة النشطة للأمراض المنقولة بالأغذية (FoodNet) أبلغ عن 9723 حالة من حالات العدوى الكامبيلوباكتر التي تم تشخيصها مختبريًا في عام 20181. ويمثل ذلك زيادة بنسبة 12% في تقارير قضية كامبيلوباكتر عن الفترة 2015-20171. في جميع أنحاء العالم، Campylobacter spp. هي من بين الالتهابات المعوية البكتيرية الأكثر شيوعا2. ومع ذلك ، فإن أعداد الأمراض المعوية القائمة على Campylobacterالتي تحدث كل عام يشتبه في أن يتم الإبلاغ عنها بشكل غير صحيح3. هذا التقليل من شأنه يمكن التنبؤ به لأن معظم المرضى يمكن أن يتعافى مع عدم الراحة المعتدلة فقط وعدم وجود علاج طبي. ومع ذلك ، بالنسبة للمرضى الذين يعانون من أعراض أكثر حدة أو الذين هم أكثر عرضة للإصابة بأمراض خطيرة ، والذين يسعون بعد ذلك إلى الرعاية الطبية ، فإن ثقافة البراز هي الطريقة الأكثر شيوعًا لتقييم ما إذا كان Campylobacter هو العامل الممرض الذي يسبب ضيقهم4.
لCampylobacter spp., ثقافة البراز هو مزعج بشكل خاص. الكائنات المسببة للأمراض الأكثر شيوعا، C. jejuni، C. القولونية، C. upsaliensis، وC. لاري، هي microaerophilic5. وهذا يعني أن البكتيريا سوف تموت عشوائيا، معدلات غير معروفة مرة واحدة تتعرض للهواء. الوقت بين جمع العينات وإعداد الثقافة وبالتالي يصبح متغير غير المنضبط في القدرة على الكشف عن قابلة للحياة Campylobacter spp. حسب الثقافة.
لثقافة مباشرة من عينات البراز، والنمو البطيء للكامبيلوباكتر هو أيضا مشكلة. مستعمرات Campylobacter صغيرة جدا حتى بعد 48 ساعة من الحضانة ويمكن تغطيتها بسهولة من قبل الكائنات الحية المتنافسة في مصفوفة البراز. وتستخدم على نطاق واسع لوحات التي تحتوي على المضادات الحيوية التي معظم سلالات من C. jejuni وC. القولونية هي مقاومة، كما تمنع المضادات الحيوية نمو العديد من (ولكن ليس كل) البكتيريا البرازالمتنافسة، مما يسمح تصور أفضل من مستعمرات كامبيلوباكتر 6. ومع ذلك ، فإن الأنواع الأخرى Campylobacter مثل C. lari و C. upsaliensis حساسة لبعض هذه المضادات الحيوية ، وإما تنمو بشكل سيئ أو لا تنمو على الإطلاق. وهذا يساهم في نقص الإبلاغ عن التهابات كامبيلوباكتر من هذه الأنواع الحساسة للمضادات الحيوية7.
هناك سبب ثالث لماذا ثقافة Campylobacter قد تكون غير دقيقة. البكتيريا، عندما شدد، قد تبقى قابلة للحياة ولكن يمكن أن تصبح “غير صالحة للزراعة”8. وهذا يعني بحكم تعريفه أن الثقافة لن تكتشف البكتيريا الموجودة في العينة. عدد المرات التي يحدث هذا غير معروف8.
وبالنظر إلى هذه القضايا المحتملة مع الثقافة، استخدمنا أساليب مرجعية مقارنة متعددة بحيث نتائج الثقافة الخاطئة لم تجعل اختبار واحد للمقارنة تظهر غير دقيقة9. تم اختيار أساليب الثقافة المستخدمة (على سبيل المثال ، لوحات Campylobacter– انتقائية ، وسيلة نقل ، أكياس توليد الغاز) لأنها تستخدم على نطاق واسع في المختبرات السريرية لثقافة عينة البراز10.
تم تطوير بروتوكولات الثقافة الموصوفة هنا لأن أقل عدد من كامبيلوباكتر جيجوني التي يمكن اكتشافها من قبل الثقافة في البراز البشري لم يكن معروفا. على الرغم من أن التقديرات قد نشرت لأعداد من وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) موجودة في براز الدواجن11،لا يمكن أن تكون هذه النتائج مساوية البراز البشري، كما Campylobacter spp. هي commensals في الدجاج، ولا تسبب الإسهال. هذه المعلومات الأساسية مطلوبة لتحديد أعداد البكتيريا Campylobacter التي من شأنها أن تنتج أعراض التهاب المعدة والأمعاء في البشر ومقارنة الفوعة بين السلالات أو الأنواع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم بناء أساليب الثقافة الموصوفة هنا على تقنيات ومواد بسيطة ومستخدمة على نطاق واسع متوفرة في معظم المختبرات10. إن الجمع بين العينات التحليلية والعينات المفتعلة هو الذي يوفر معلومات جديدة عن عتبة الكشف ذات الصلة سريرياً لثقافات البراز. بالإضافة إلى ذلك، الفصل في نتائج الثقافة مع 5 مقالات منفصلة يعزز الاستنتاجات التي Campylobacter ثقافة البراز mis-يحدد جزء كبير من عينات المريض. واختبارات تقييم الأثر البيئي والمواد الجزيئية مفيدة كضوابط لأن كل منها يستند إلى مبدأ مختلف (تفاعل المستضد مع الأجسام المضادة مقابل تضخيم الحمض النووي) والأهم من ذلك، لا تعتمد على صلاحية البكتيريا. لاحظ أن فحص تقييم الأثر البيئي المستخدم في هذه الدراسات تم التحقق منه بشكل جيد وقد ثبت أنه يتفق تمامًا مع 4 اختبارات جزيئية12.
إن ثقافة Campylobacter spp. مزعجة بشكل خاص، حيث تفيد التقارير بأن الحساسية تتراوح بين 60-76٪19،20، وكما هو واضح من معدل الفشل في اكتشاف العينات الإيجابية الحقيقية هنا بنسبة 30٪. يمكن للموظفين أن يتوقعوا أن التحكم في تقييم الأثر البيئي والاختبارات الجزيئية ستسفر في كثير من الأحيان عن نتائج إيجابية عندما تكون بيانات الثقافة سلبية.
الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي تحديد مستعمرات دبوس نقطة بين النباتات البراز المتنافسة. وليس من غير المألوف، كتخفيفات بالقرب من عتبة الكشف، أن يكون هناك تقديرات بالتناوب لعدد المستعمرات صفر امن وغير صفر (على سبيل المثال، 2، 0، 1، 0، 0). ومن المهم الاعتراف بأن عتبات الثقافة ستكون مجموعة من التركيزات، وليس تركيزاً محدداً من نوع CFU/mL. ومع ذلك ، فإن تقدير ~ 1 × 106 CFU / mL البراز كحد أدنى للكشف عن الثقافة يقارن بشكل جيد مع التقارير التي البشر المصابين تسليط 106 إلى 109Campylobacter لكل البراز غرام21. التغيرات في المضادات الحيوية أو لوحات أجار والاختلافات التي لا مفر منها في عينات البراز الفردية سوف تغير بلا شك قيم العتبة. يجب أن يمكّن هذا البروتوكول من إدخال تحسينات على وسائط النمو.
هذه المعلومات الأولى عن الحد من الكشف عن الثقافة يجعل من الممكن لوضع عتبات ذات الصلة سريريا لاختبارات التشخيص، ويضع الأساس الميكروبيولوجي الذي هو مطلوب لمعالجة القضايا غير المدروسة من غير أعراض النقل22،23 من قبل Campylobacter،أو إذا كان الحمل البكتيري يرتبط مع الأعراض أو عواقب خطيرة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسات من قبل TECHLAB، وشركة
Materials
| Anaerobic 3.5L Jar | Thermo Fisher | HP0031A | |
| AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar | Hardy Diagnostics | AG701 | |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD Biosciences | 237500 | |
| Bacto Protease Peptone | Life Technologies Corp | 211684 | |
| Basic Fuchsin | Fisher Scientific | B12544 | |
| BBL Trypticase Peptone | Life Technologies Corp | 211921 | |
| C. coli Type strain | ATCC | 33559 | |
| C. jejuni Type strain | ATCC | 33560 | |
| CampyGen gas generating system sachet | Thermo Fisher | CN0025A | |
| Campylobacter QUIK CHEK | TechLab, Inc. | T5047 / T31025 | |
| Cary-Blair transport medium | Fisher Scientific | 23-005-47 | |
| Coli Roller Sterile plating beads | Millipore Sigma | 71013 | |
| Dilution Buffer | Anaerobe Systems | AS-908 | |
| Fetal bovine serum | Equitech-Bio, Inc | SFBM30 | |
| Sodium bisulfite | Sigma-Aldrich | 243973 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 |
References
- . Annual Summaries of Foodborne Outbreaks Available from: https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html (2018)
- Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. Global Epidemiology of Campylobacter Infection. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 687-720 (2015).
- Pitkanen, T. a., H, M. L., Rose, J. B., Jimenez-Cisneros, B. . Global Water Pathogen Project. , (2017).
- Fitzgerald, C., et al. Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool. Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1209-1215 (2016).
- Kirkpatrick, B. D., Tribble, D. R. Update on human Campylobacter jejuni infections. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (1), 1-7 (2011).
- CDC. Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2013. Morbidity and Mortality Weekly Report. 63, 328-332 (2014).
- Jaime, A. L., et al. Campylobacter upsaliensis: Another Pathogen for Consideration in the United States. Clinical Infectious Diseases. 34 (11), 59-60 (2002).
- Bullman, S., O’Leary, J., Corcoran, D., Sleator, R., Lucey, B. Molecular-based detection of non-culturable and emerging campylobacteria in patients preseting with gastroenteritis. Epidemiology and Infection. 140, 684-688 (2012).
- Giltner, C. L., Saeki, S., Bobenchik, A. M., Humphries, R. M. Rapid Detection of Campylobacter Antigen by Enzyme Immunoassay Leads to Increased Positivity Rates. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 618-620 (2013).
- M’ikanatha, N. M., et al. Culturing stool specimens for Campylobacter spp., Pennsylvania, USA. Emerging Infectious Disease. 18, 484-487 (2012).
- Al Amri, A., Senok, A. C., Ismaeel, A. Y., Al-Mahmeed, A. E., Botta, G. A. Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools. Journal of Medical Microbiology. 56 (10), 1350-1355 (2007).
- Buss, J. E., et al. Campylobacter culture fails to correctly detect Campylobacter in 30% of positive patient stool specimens compared to non-cultural methods. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38, 1087-1093 (2019).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Couturier, B. A., Hale, D. C., Couturier, M. R. Association of Campylobacter upsaliensis with Persistent Bloody Diarrhea. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3792-3794 (2012).
- Chaban, B., Musil, K. M., Himsworth, C. G., Hill, A. K. Development of cpn60-Based Real-Time Quantitative PCR Assays for the Detection of 14 Campylobacter Species and Application to Screening of Canine Fecal Samples. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3055-3061 (2009).
- Allos, B., Blaser, M. J., Mandell, G. L., Bennett, J. E., Dolin, R. . Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed. , 2793-2802 (2009).
- Anderson, N. W., Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Comparison of the BD MAX Enteric Bacterial Panel to Routine Culture Methods for Detection of Campylobacter, Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157), Salmonella, and Shigella Isolates in Preserved Stool Specimens. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1222-1224 (2014).
- Wasfy, M., Oyofo, B., Elgindy, A., Churilla, A. Comparison of preservation media for storage of stool samples. Journal of Clinical Microbiology. 33 (8), 2176-2178 (1995).
- Bessède, E., Delcamp, A., Sifre, E., Buissonniere, A., Mégraud, F. New Methods for Detection of Campylobacters in Stool Samples in Comparison to Culture. Journal of Clinical Microbiology. 49 (3), 941-944 (2011).
- Bessède, E., et al. Evaluation of the Diagnostic Accuracy of Two Immunochromatographic Tests Detecting Campylobacter in Stools and Their Role in Campylobacter Infection Diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), (2018).
- Shane, A. L., et al. Infectious Diseases Society of America Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea. Clinical Infectious Diseases. 65 (12), 1963-1973 (2017).
- Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Astudillo, X., Fernández, H. Occurrence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter species isolated from healthy children attending municipal care centers in Southern Ecuador. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 59, 77-77 (2017).
- Lee, G., et al. Symptomatic and asymptomatic Campylobacter infections associated with reduced growth in Peruvian children. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (1), 2036 (2013).
