クロマチン構成の計算解析を用いたアルツハイマー病変異体の標的遺伝子へのマッピング

1. ワークステーションのセットアップ R (バージョン 3.5.0) と RStudio デスクトップをインストールします。RStudio を開きます。 RStudio のコンソール ウィンドウに次のコードを入力して、R に次のライブラリをインストールします。if (!BiocManager” %in% 行名(インストール済み.パッケージ()))install.packages(“BiocManager”, リポジトリ=”https://cran.r-project.org”)バイオクマネージャー::インストール(「ゲノム範囲」)バイオクマネージャー::インストール(「バイオマート」)バイオクマネージャー::インストール(「WGCNA」)install.packages(“形状変更”)インストール.パッケージ(“ggplot2”)インストール.パッケージ(“corrplot”)インストール.パッケージ(“gProfileR”)install.packages(“きちんとしたバース”)install.packages(“ggpubr”) ファイルをダウンロードします。注: このプロトコルでは、すべてのファイルを ~/work ディレクトリにダウンロードする必要があります。 資料の表に記載されているリンクをクリックして、次のファイルをダウンロードします。 AD 用の細かくマッピングされた信頼できる SP をダウンロードします (補足表 8 から Jansen et al.14)。注 : 分析の前に、41588_2018_311_MOESM3_ESM.xlsx でシート 8 を開き、最初の 3 行を削除し、シートをタブ区切り形式でSupplementary_Table_8_Jansen.txt として保存します。 サイチェンコードから成人脳内の10 kb解像度Hi-C相互作用プロファイルをダウンロードします(以下のプロモーター-anchored_chromatin_loops.bedと説明します)。注: このファイルの形式は、染色体、TSS_start、TSS_end、Enhancer_start、およびEnhancer_endです。他の Hi-C データセットを使用する場合、このプロトコルでは高解像度(5~20 kb)で処理される Hi-C データセットが必要です。 PsychENCODE から単一セル式データセットをダウンロードします。メモ:これらは神経型対照サンプルからのものです。 BrainSpan から発達表現データセットをダウンロードします (以下のdevExpr.rdaと説明します)。注: 267666527 は zip ファイルであるため、267666527 を解凍して “columns_metadata.csv”、”expression_matrix.csv”、および “rows_metadata.csv” を抽出して devExpr.rda を生成します (セクション 3 を参照)。 Gencode バージョン 19 からエキサニック座標(Gencode19_exon.bedおよびGencode19_promoter.bedとして説明) のエキサニック座標をダウンロードします。 注: プロモーターは、転写開始サイト (TSS) の上流に 2 kb として定義されます。これらのファイルの形式は、染色体、開始、終了、および遺伝子です。 バイオマートから遺伝子注釈ファイル(下記geneAnno.rdaとして説明する補足ファイルを参照)をダウンロードしてください。注:このファイルは、Ensembl遺伝子IDとHUGO遺伝子命名法委員会(HGNC)シンボルに基づいて遺伝子を一致させるために使用することができます。 2. 信頼できる SP の G範囲オブジェクトの生成 RStudio のコンソール ウィンドウに次のコードを入力して、R で設定します。図書館(ゲノム範囲)オプション(文字列AsFactors = F)setwd(“~/work”) # これは作業ディレクトリへのパスです。credSNP = read.delim(“Supplementary_Table_8_Jansen.txt”, ヘッダー = T)credSNP = credSNP[credSNP$信頼できる.コーサル==”はい”,] RStudio のコンソール ウィンドウに次のコードを入力して、GRanges オブジェクトを作成します。クレドランジ = GRanges (credSNP$Chr, IRanges (credSNP$bp, credSNP$bp), rsid=credSNP$SNP, P=credSNP$P)保存(クレドレンジ、ファイル=”AD_credibleSNP.rda”) 3. 位置マッピング 注: 各手順で、RStudio のコンソール ウィンドウに対応するコードを入力します。 R で設定します。オプション(文字列AsFactors=F)図書館(ゲノム範囲)load(“AD_credibleSNP.rda”) # (2を参照) プロモーター/エキソニックSNの遺伝子への位置マッピング プロモーターとエキゴニック領域をロードし、GRange オブジェクトを生成します。exon = read.table(“Gencode19_exon.bed”)エキソン範囲 = GRanges(エキソン[,1],IRanges(エキソン[,2],エキソン[,3]),遺伝子=エキソン[,4])プロモーター = 読み取り.テーブル(“Gencode19_promoter.ベッド”)プロモーター範囲 = GRanges(プロモーター[1], IRanges(プロモーター[,2], プロモーター[,3]), 遺伝子=プロモーター[,4]) 信頼できる SP とエキサニック領域を重複させます。olap = 検索オーバーラップ(クレドレンジ、エクソンレンジ)クレデキソン = クレドレンジ[クエリヒット(olap)]mcols(クレデクソン) = cbind(mcols(クレデキソン),mcols(エキソンレンジス[被験者ヒット(olap)])) 信頼できる SP とプロモーター領域を重複させます。olap = 検索オーバーラップ(クレドレンジ、プロモーターレンジ)クレドプロモーター = クレドレンジ[クエリヒット(olap)]mcols(クレドプロモーター) = cbind(mcols(クレドプロモーター)、mcols(プロモーターランジュ[サブジェクトヒット(olap)])) クロマチン相互作用を用いてSPをその段階標的遺伝子にリンクする。 Hi-C データセットを読み込み、GRange オブジェクトを生成します。hic = read.table(“プロモーター-anchored_chromatin_loops.ベッド”, スキップ = 1)コル名(hic) = c(“chr”,”TSS_start”,”TSS_end”, “Enhancer_start”, “Enhancer_end”)ヒクロスジ = GRanges(hic$chr,IRanges(TSS_start、TSS_end)、エンハンサー=ハイク$Enhancer_start)olap = 検索オーバーラップ(ヒスクション、プロモーター範囲)ヒカピュア = ヒクション[クエリヒット(olap)]mcols(ヒクプロモーター) = cbind(mcols(ヒップロモーター)、mcols(プロモーター範囲[サブジェクトヒット(olap)]))ヒカエンサー = GRanges(セクネーム(ヒップロモーター)、IRanges(ヒップロモーター$エンハンサー、ヒップロモーター$エンハンサー+10000)、遺伝子=ヒップロモーター$遺伝子) 信頼できる SP を Hi-C GRange オブジェクトと重なっています。olap = 重複する(クレドランジ、ヒカエンブラー)クレドシック = クレドレンジ[クエリヒット(olap)]mcols(クレディック) = cbind(mcols(クレディック), mcols(ヒカエンブラー[サブジェクトヒット(olap)])) 位置マッピングおよびクロマチン相互作用プロファイルによって定義されるAD候補遺伝子をコンパイルする。### AD の結果として得られる候補遺伝子:ADgenes = Reduce(ユニオン、リスト(クレデキソン$遺伝子、クレデキソン$遺伝子、クレドプロモーター$遺伝子))### を変換すると、Ensembl ジーン ID が HGNC シンボルに変換されます。負荷(「geneAnno.rda」)ADhgnc = geneAnno1[一致(ADgenes, geneAnno1$ensembl_gene_id), “hgnc_symbol”]ADhgnc = ADhgnc[ADhgnc!=””保存(ADgenes, ADhgnc, ファイル=”ADgenes.rda”)write.table(ADhgnc, ファイル=”ADgenes.txt”, 行名 =F, col.names=F, 見積もり =F, sep=”\t”) 4. 発達表現軌道 注: 各手順で、RStudio のコンソール ウィンドウに対応するコードを入力します。 R で設定します。ライブラリ(形状変更);図書館(ggplot2);図書館(ゲノム範囲);図書館(バイオマート)図書館(“WGCNA”)オプション(文字列AsFactors=F) プロセス式とメタ データ。datExpr = 読み取り.csv(“expression_matrix.csv”、ヘッダー = FALSE)datExpr = datExpr[,-1]datMeta = read.csv(“columns_metadata.csv”)datProbes = read.csv(“rows_metadata.csv”)datExpr = datExpr[datProbes$ensembl_gene_id!=””,]datProbes = datProbes[datProbes$ensembl_gene_id!=””,]datExpr.cr= 折りたたみ行(datExpr、行グループ = datProbes$ensembl_gene_id、行 ID= 行名(datExpr))datExpr = datExpr.cr$datET 折りたたみgename = データフレーム(datExpr.cr$group2row)行名(datExpr) = ゲナメ$グループ 開発段階を指定します。datMeta$ユニット = “出生後”idx = grep(“pcw”, datMeta$age)datMeta$ユニット[idx] = “出生前”idx = grep(“yrs”, datMeta$age)datMeta$ユニット[idx] = “出生後”datMeta$ユニット = 係数(ダットメタ$ユニット、レベル=c(“出生前”、”出生後”)) 皮質領域を選択します。datMeta$Region = “サブCTX”r = c(“A1C”、”STC”、”ITC”、”TCx”、”OFC”、”DFC”、”VFC”、”MFC”、”M1C”、”S1C”、”IPC”、”M1C-S1C”、”PCx”、”V1C”、”Ocx”)datMeta$Region[datMeta$structure_acronym %in% r] = “CTX”datExpr = datExpr[,datMeta = datMeta[保存(ダットエクスププル、ダットメタ、ファイル=”devExpr.rda”) ADリスク遺伝子の発達発現プロファイルを抽出する。負荷(「アドゲネス.rda」)exprdat = 適用(datExpr[一致(ADgenes,行名(datExpr)),],2,平均,na.rm=T)dat = data.frame(領域 = datMeta$領域、単位=datMeta$ユニット、Expr=exprdat) ADリスク遺伝子の出生前および出生後発現レベルを比較する。pdf(ファイル=”developmental_expression.pdf”)ggplot(dat,aes(x=単位,y=Expr,fill=Unit,α=単位)) + ylab(“正規化式”) + geom_boxplot(外れ値.サイズ = NA) + ggtitle(“脳表現”) + scale_alpha_manual(値=c(0.2, 1)) + theme_classic() + テーマ(伝説)dev.off() 5. セル型式プロファイル 注: 各手順で、RStudio のコンソール ウィンドウに対応するコードを入力します。 R で設定します。オプション(文字列AsFactors=F)負荷(「アドゲネス.rda」)負荷(「geneAnno.rda」)ターゲット名 = “AD”ターゲット遺伝子 = ADhgnccellexp = read.table(“DER-20_Single_cell_expression_processed_TPM_backup.tsv”,ヘッダ=T,塗りつぶし=T)cellexp[1121,1] = cellexp[1120,1]cellexp = cellexp[-1120,]行名(セルエクスプ) = セルエクスプ[,1]cellexp = cellexp[,1]datExpr = スケール(セルエクスプ、センター=T、スケール=F)datExpr = datExpr[,789:ncol(datExpr)] ADリスク遺伝子の細胞発現プロファイルを抽出する。exprdat = 適用(datExpr[一致(ターゲットジーン、行名(datExpr)))、]、2、平均、na.rm=T)dat = data.frame(グループ=ターゲット名、セル=名前(exprdat)、Expr=exprdat)dat$celltype = リストなし(lapply(strsplit(dat$cell, split=”[.]”),'[[‘,1))dat = dat[-grep(“Ex|In”,dat$celltype),]dat$celltype = gsub(“Dev”,”胎児”,dat$celltype)dat$celltype = 因子(dat$celltype, レベル=c(“ニューロン”,”アストロサイト”,”ミクログリア”,”内皮”,オリゴデンドロサイト”,”OPC”,”胎児”))pdf(ファイル=”singlecell_expression_ADgenes.pdf”)ggplot(dat,aes(x=セルタイプ, y=Expr, 塗りつぶし=セルタイプ)) +ylab(“正規化式”) + xlab(“) + geom_violin() + テーマ(軸.テキスト.x=element_text(角度 = 90, hjust=1)) + テーマ(凡例.位置=”なし”) +ggtitle(ペースト0(「ADリスク遺伝子の細胞発現プロファイル」))dev.off() 6. ADリスク遺伝子の遺伝子アノテーション濃縮解析 ターミナルに以下のコマンドを入力して HOMER をダウンロードして設定します。mkdir ホーマーcd ホーマーwget http://homer.ucsd.edu/homer/configureHomer.plperl ./configureHomer.pl -installperl ./configureHomer.pl -人間をインストールします。perl ./configureHomer.pl -人間をインストールします。 ターミナルに以下のコマンドを入力してHOMERを実行します。エクスポート PATH=$PATH:~/仕事/ホーマー/ビンfindMotifs.pl ~/仕事/ADgenes.txt ヒト ~/仕事/ RStudio のコンソール ウィンドウに次のコードを入力して、強化された用語をプロットします。図書館(ggpubr)オプション(文字列AsFactors=F)pdf(“GO_enrichment.pdf”,幅 = 15,高さ=8)plot_barplot = 関数(dbname,name,color){入力 = 読み取り.delim(貼り付け0(dbname,.txt”)、ヘッダー =T)入力 = 入力[,c(-1,-10,-11)]入力 = 一意(入力)入力$FDR = p.調整(入力$ログP))input_sig = 入力[入力$FDR < 0.1,]input_sig$FDR = -log10(input_sig$FDR)input_sig = input_sig[オーダー(input_sig$FDR),]p = input_sig、x = “用語”、y = “FDR”、塗りつぶし = 色、色 = “白”、 sort.val = “asc”, ylab = expression(-log[10](FDR))), xlab = paste0(名前,用語”), 回転 = = TRUE, ラベル = input_sigターゲット.Genes.in.Term,/”,input_sig$Genes.in.Term), font.label = list(色 = 白”, サイズ = 9)p = p+geom_hline(yintercept = -log10(0.05)、線種 = 2、色 = “ライトグレー”)リターン(p)}p1 = plot_barplot(「biological_process」「生物学的プロセスに従#00AFBB)。p2 = plot_barplot(“kegg”,”KEGG”,”#E7B800″)p3 = plot_barplot(“反応”,”反応#FC4E07″)ggarrange(p1, p2, p3, ラベル = c(“A”, “B”, “C”), ncol = 2, nrow = 2)dev.off()