Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme
Summary
Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM’ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.
Abstract
Proteinlerin ubikitin (ub) ve ubiquitin benzeri (ubl) bağımlı post-translational modifikasyonları protein stabilitesini, aktivitesini, etkileşimlerini ve hücre içi lokalizasyonunu kontrol ederek hücre içinde temel biyolojik düzenleyici rolleri oynar. Hücrenin sinyallere yanıt vermesine ve çevredeki değişikliklere uyum sağlamasına olanak sağlar. Bu mekanizmalar içinde değişiklikler nörodejeneratif hastalıklar ve kanserler gibi ciddi patolojik durumlara yol açabilir. Burada açıklanan tekniğin amacı, kültürlü hücre çizgilerinden ub/ubls bağımlı PTM profillerinin hızlı ve doğru bir şekilde oluşturulmasıdır. Farklı koşullardan elde edilen farklı profillerin karşılaştırılması, örneğin bir tedavi tarafından indüklenenler gibi belirli değişikliklerin tanımlanmasına olanak tanır. Lentiviral aracılı hücre transdüksiyonu, değiştiricinin (ubiquitin veya SUMO1 veya Nedd8 gibi bir ubl) iki tag (6His ve Bayrak) sürümünü ifade eden kararlı hücre çizgileri oluşturmak için gerçekleştirilir. Bu etiketler her yerde saflaştırma ve bu nedenle hücrelerden her yerde proteinlerin izin verir. Bu iki aşamalı bir arınma işlemi ile yapılır: İlki 6His etiketi kullanılarak denatüre koşullarında gerçekleştirilir ve ikincisi bayrak etiketi kullanılarak yerel koşullarda gerçekleştirilir. Bu, daha sonra sıvı kromatografi spektrografi ve tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) teknolojisi ile tanımlanan ve yarı-nicelleştirilmiş modifiye proteinlerin son derece spesifik ve saf izolasyonuna yol açar. Excel yazılımını kullanarak MS verilerinin kolay enformatik analizi, arka plan sinyallerini ortadan kaldırarak PTM profillerinin oluşturulmasını sağlar. Bu profiller, standart biyokimya teknikleri ile doğrulanmalarından başlayarak, daha spesifik olarak incelenecek belirli değişiklikleri belirlemek için her durum arasında karşılaştırılır.
Introduction
Burada önerilen yöntem, belirli bir durumla ilişkili potansiyel değişiklikleri (tedavi, farklılaşma, vb.) belirlemek için kültürlü memeli hücrelerinden ubikitin aile üyeleri tarafından aracılık edilen PtM’leri incelemek için ayrılmıştır. Ptm’ler proteinlerin fonksiyonlarının düzenlenmesinin son adımını temsil eder1. Nitekim, bir kez çeviri makineleri tarafından üretilen, çoğu değilse tüm proteinler kendi aktivitesini modüle PTM’ler farklı türde uğrar, moleküler etkileşimleri, ve hücre içi konumu1. PtM bolluk arasında proteinlerin ubiquitin ailesi tarafından aracılık olanlar, ubiquitin kendisi ve tüm ubikitin benzeri, tüm hücre içi veya kısmen sitoplazmik proteinleri düzenlemek için potansiyele sahip2. Kendileri protein oldukları için, her biri belirli düzenleyici işlevlerle ilişkili homojen ve heterojen çeşitli topolojilerin homojen ve heterojen zincirlerini oluşturarak birbirlerine konjuge edilebilirler2. Bu karmaşık makineyi çözmek ve anlamak için araçlara ihtiyaç vardır. Birçok yaklaşımlar dünya çapında, kendi avantajları ve dezavantajları olan geliştirilmiştir ve burada kültürlü hücreler için uygun yüksek performanslı bir öneriyoruz.
Bu yöntemin en büyük avantajı doğruluğudur. Nitekim, izole modifiye proteinlerin saflığı son derece iki etiket (6His ve Bayrak) ve iki adım prosedürü kombinatoryal kullanımı ile geliştirilmiş ve bu nedenle tek bir etiket füzyon ub / Ubl3çok daha seçici olduğunu,4. 6His etiketinin varlığı, tamamen inkar eden bir durumda arınmanın ilk adımını sağlar ve böylelikle ubikitin bağlayıcı etki alanları veya her yerde bulunanlara bağlanan diğer proteinler içeren proteinlerin birlikte saflaştırılmasından kaçınır. Bu teknik bir sorun ya spesifik antikorlar5 veya tandem ubiquitin bağlayıcı elemanları (TUBEs)6kullanarak ubiquitinated proteomların yakınlık saflaştırma dayalı birçok diğer yaklaşımlar tarafından karşılaşılan bir teknik sorundur . Daha da önemlisi, bu teknik her yerde belirli bir tür arınma lehine önyargılı değildir, bu bazı diğer yaklaşımlar için durum olabilir gibi, poliubiquitinations hem mono ve farklı türde tespit edildi beri7. Sonuç olarak, bir kez bulundu, ubiquitination bir değişiklik ilgili her yerde tam türünü belirlemek için standart biyokimyasal yaklaşımlar tarafından daha ayrıntılı olarak incelenmesi gerekecektir.
Son olarak, bu protokolün bir diğer teknik avantajı, normal hücresel davranışa müdahale etmeden etiketli değiştiriciifadelerinin makul düzeyde olan kararlı ifade hücre çizgileri oluşturan lentivirüslerin kullanımıdır.
Ubikitinasyonun önemli bir rolü proteazomal bozulma için proteinleri hedeflemek ise, şimdi potansiyel olarak en hücre içi veya kısmen hücre içi proteinler için birçok düzenleyici özelliklere sahip olduğu bilinmektedir1. Bu fonksiyonların sayısı daha proteinler gibi birçok ubiquitin varlığı ile artar, proteinlerin hemen hemen her hücre mekanizması nı düzenleyen bir aile oluşturan1. Onların değişiklikler hücre biyolojisi üzerinde köklü etkisi olabilir ve yol açabilir veya patolojikdurumlarakatılabilir 8 , kanser gibi9. Bu nedenle, araçlar bu geniş manzara keşfetmek ve yeni terapötik hedefler olarak hizmet verebilir patolojik bir durum ile ilişkili değişiklikleri belirlemek için gereklidir.
Bu protokol, ub/Ubl etiketli eksojeni ifade etmek için transeksedilmesi gerektiğinden kültürdeki hücrelere adanmıştır. Oluşturulduktan sonra, bu kararlı hücre çizgileri 2D veya 3D veya ksenogreft kültüründen Ubl profilleri oluşturmak için kullanılabilir, böylelikle PTM profilleri çalışmak için uygulanabilir farklı deneysel modellerin ufkunu genişleterek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz ana ubikitin aile üyeleri tarafından modifiye protein profilleri oluşturmak için sağlam ve güvenilir bir metodoloji geliştirdik. Nitekim, biz başarıyla ubiquitin tarafından PTMs profilleri oluşturmak için bu protokolü uyguladık, ve ayrıca SUMO ve Nedd8 tarafından, ve bir tedavi ile ilişkili değişiklikleri tespit etmekiçin 7, belirli bir genin aşırı ifade veya nakavt yanıt olarak (veri değil gösterilen) ve çeşitli kemoterapötik ilaçlara dirençli fenotip edinilen h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma La Ligue Contre le Cancer tarafından HV ve MS’e ve ARC (dernek pour la recherche sur le cancer) tarafından PS, INCa (institute national du cancer) ve Canceropole PACA to JI tarafından desteklendi. IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, Cancéropôle PACA, Provence-Alpes-Côte d’Azur tarafından desteklenen Marsilya Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) kütle spektrometresi tesisi Région, Institut Paoli-Calmettes ve Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
References
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature’s escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).
- Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin. Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Matsumoto, M., et al. Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome. Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).
- Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins. Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).
- Bonacci, T., et al. Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).
- Hoeller, D., Dikic, I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy. Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).
- Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
