Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas
Summary
Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.
Abstract
Las modificaciones post-traduccionales dependientes de la ubiquitina (ub) y la ubiquitina (ubl) dependientes de las proteínas desempeñan un papel regulador biológico fundamental dentro de la célula mediante el control de la estabilidad de las proteínas, la actividad, las interacciones y la localización intracelular. Permiten a la célula responder a las señales y adaptarse a los cambios en su entorno. Las alteraciones dentro de estos mecanismos pueden conducir a situaciones patológicas graves como enfermedades neurodegenerativas y cánceres. El objetivo de la técnica descrita aquí es establecer perfiles de PTF dependientes de ub/ubls, de forma rápida y precisa, a partir de líneas celulares cultivadas. La comparación de diferentes perfiles obtenidos a partir de diferentes condiciones permite la identificación de alteraciones específicas, como las inducidas por un tratamiento, por ejemplo. La transducción celular mediada por Lentiviral se realiza para crear líneas celulares estables que expresan una versión de dos etiquetas (6His y Flag) del modificador (ubiquitina o ubl como SUMO1 o Nedd8). Estas etiquetas permiten la purificación de la ubiquitina y por lo tanto de proteínas ubiquitinadas de las células. Esto se hace a través de un proceso de purificación de dos pasos: El primero se realiza en condiciones de desnaturalización utilizando la etiqueta 6His, y el segundo en condiciones nativas usando la etiqueta Flag. Esto conduce a un aislamiento muy específico y puro de proteínas modificadas que posteriormente se identifican y semicuantifican mediante cromatografía líquida seguida de tecnología de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). El fácil análisis informático de los datos de MS mediante el software Excel permite el establecimiento de perfiles PTM mediante la eliminación de señales de fondo. Estos perfiles se comparan entre cada condición con el fin de identificar alteraciones específicas que luego se estudiarán más específicamente, comenzando con su validación por técnicas de bioquímica estándar.
Introduction
El método propuesto aquí está dedicado a estudiar los PTM mediados por los miembros de la familia ubiquitina a partir de células de mamíferos cultivadas con el fin de identificar posibles alteraciones asociadas con una condición específica (tratamiento, diferenciación, etc.). Los PPT representan el último paso de regulación de las funciones de las proteínas1. De hecho, una vez producidas por la maquinaria traslacional, la mayoría, si no todas las proteínas, se someten a diferentes tipos de MPT que modulan su actividad, interacciones moleculares y ubicación intracelular1. Entre las plétolas de LOS PTM se encuentran las mediadas por la familia de proteínas ubiquitina, la ubiquitina en sí y todas las ubiquitinas, tienen el potencial de regular todas las proteínas intracelulares o parcialmente citoplasmáticas2. Debido a que son en sí mismas proteínas, se pueden conjugar entre sí, formando cadenas homogéneas y heterogéneas de diversas topologías, cada una asociada con funciones reguladoras específicas2. Se necesitan herramientas para tratar de descifrar y comprender esta compleja maquinaria. Muchos enfoques fueron desarrollados en todo el mundo, teniendo sus propias ventajas y desventajas, y aquí proponemos uno con alto rendimiento adecuado para células cultivadas.
La principal ventaja de este método es su precisión. De hecho, la pureza de las proteínas modificadas aisladas se ve muy mejorada por el uso combinatorio de las dos etiquetas (6His y Flag) y los dos pasos-procedimiento y por lo tanto es mucho más selectivo que una sola fusión de etiqueta Ub/Ubl3,4. La presencia de la etiqueta 6His permite un primer paso de purificación en una condición de desnaturalización completa evitando así cualquier co-purificación de proteínas que contengan dominios de unión a ubiquitina u otras proteínas que se unen a los ubiquitinados. Este es un problema técnico encontrado por varios otros enfoques basados en la purificación de afinidad de proteomes ubiquitinados utilizando anticuerpos específicos5 o elementos de unión de ubiquitina en tándem (TUBEs)6. Es importante destacar que esta técnica no está sesgada a favor de la purificación de un determinado tipo de ubiquitinación, como podría ser el caso de algunos otros enfoques, ya que se identificaron tanto mono como diferentes tipos de poliubiquitinaciones7. En consecuencia, una vez que se encuentre, una alteración de la ubiquitinación tendrá que ser estudiada en más detalle por enfoques bioquímicos estándar con el fin de identificar el tipo exacto de ubiquitinación involucrada.
Por último, otra ventaja técnica de este protocolo es el uso de lentivirus, que crea fácil y rápidamente líneas celulares de expresión estables con un nivel razonable de expresiones de modificador etiquetado sin interferir con el comportamiento celular normal.
Mientras que un papel importante de la ubiquitinación es apuntar a las proteínas para la degradación proteasomal, ahora se sabe que tiene muchas otras propiedades reguladoras para potencialmente la mayoría de las proteínas intracelulares o parcialmente intracelulares1. El número de estas funciones se incrementa aún más por la existencia de muchas ubiquitinas como proteínas, formando una familia de proteínas que regulan casi todos los mecanismos celulares1. Sus alteraciones pueden tener un impacto drástico en la biología celular y pueden conducir o participar en situaciones patológicas8,como el cáncer9. Por lo tanto, se necesitan herramientas para explorar este vasto paisaje e identificar las alteraciones asociadas con una condición patológica que podría servir como nuevas dianas terapéuticas.
Este protocolo está dedicado a las células en el cultivo ya que necesitan ser transducidas para expresar exógena etiquetada Ub/Ubl. Una vez creadas, estas líneas celulares estables se pueden utilizar para generar perfiles Ubl a partir de cultivos en 2D o 3D o xenoinjertos, extendiendo así el horizonte de los diferentes modelos experimentales que se pueden aplicar para estudiar perfiles de PTM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado una metodología robusta y fiable para generar perfiles de proteínas modificados por los principales miembros de la familia ubiquitina. De hecho, hemos aplicado con éxito este protocolo para generar perfiles de PTM según ubiquitina, y también por SUMO y Nedd8, y para detectar alteraciones asociadas con un tratamiento7,en respuesta a la sobreexpresión o derribo de un determinado gen (datos no y en las células que adquirieron un fenotipo resistente a diversos fármacos quimi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por La Ligue Contre le Cancer a HV y MS, y el ARC (association pour la recherche sur le cancer) a PS, INCa (instituto nacional del cáncer) y Canceropole PACA a JI. La instalación de espectrometría de masas de Marsella Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) con el apoyo de IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, la Cancéropéle PACA, la Provenza-Alpes-Costa Azul Région, el Institut Paoli-Calmettes y el Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
References
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