Профилирование убиквитин и убиквитин-подобных зависимых посттрансляционных модификаций и выявление значительных изменений

Предложенный здесь метод предназначен для изучения ПТМ при посредничестве членов семьи убиквитин из культивированных клеток млекопитающих, с тем чтобы определить потенциальные изменения, связанные с конкретным условием (лечение, дифференциация и т.д.). ПТМ представляют собой последний этап регуляции функций белков^1. Действительно, когда-то производится переводного механизма, большинство, если не все белки проходят различные виды ПТМ, которые модулируют их активность, молекулярные взаимодействия, и внутриклеточного расположения¹. Среди множества ПТМ являются те, опосредовано семьи убиквитин белков, убиквитин себя и все убиквитин-любит, имеют потенциал для регулирования всех внутриклеточных или частично цитоплазматических белков². Потому что они сами белки, они могут быть сопряжены друг с другом, образуя однородные и неоднородные цепи различных топологий, каждый из которых связан с конкретными регулятивными функциями². Инструменты необходимы, чтобы попытаться расшифровать и понять этот сложный механизм. Многие подходы были разработаны во всем мире, имея свои преимущества и недостатки, и здесь мы предлагаем один с высокой производительностью подходит для культивированных клеток.

Основным преимуществом этого метода является его точность. Действительно, чистота изолированных модифицированных белков значительно улучшилась за счет комбинаторного использования двух тегов (6His и Flag) и двух шагов-процедур, и поэтому он гораздо более избирательным, чем один тег слияния Ub/Ubl^3,4. Наличие тега 6His позволяет первый шаг очистки в полностью денатурации состоянии тем самым избегая каких-либо совместной очистки белков, содержащих убиквитин связывания доменов или других белков, связывающихся с вездесущими. Это техническая проблема, с которой сталкиваются несколько других подходов, основанных на сродстве очистки убиквитинаированных протеомсов с использованием либо конкретных антител⁵ или тандема убиквитин связывающих элементов (TUBEs)⁶. Важно отметить, что этот метод не является предвзятым в пользу очищения определенного типа вездесущности, как это может быть в случае некоторых других подходов, так как как моно и различные виды полиубичинаций были определены⁷. Следовательно, как только будет установлено, что изменение убиквитинации должно быть изучено более подробно с помощью стандартных биохимических подходов, с тем чтобы определить точный вид убиквитина.

Наконец, еще одним техническим преимуществом этого протокола является использование лентивирусов, которые легко и быстро создают стабильные экспрессионные клеточные линии с разумным уровнем выражений помеченного модификатора, не мешая нормальному клеточному поведению.

В то время как одна важная роль повсеместновиления заключается в целевой белков для протеасомальной деградации, в настоящее время известно, что он имеет много других регуляторных свойств для потенциально наиболее внутриклеточных или частично внутриклеточных белков¹. Количество этих функций еще больше усиливается существованием многих убиквитин, как белки, образуя семейство белков, регулирующих почти каждый клеточный механизм¹. Их изменения могут иметь резкое влияние на биологию клеток и может привести или участвовать в патологических ситуациях⁸, таких как рак⁹. Таким образом, инструменты необходимы для изучения этого обширного ландшафта и определить изменения, связанные с патологическим состоянием, которое может служить в качестве новых терапевтических целей.

Этот протокол предназначен для клеток в культуре, так как они должны быть трансуктором, чтобы выразить экзогенные помечены Ub / Ubl. После создания эти стабильные клеточные линии могут быть использованы для генерации профилей Ubl из культуры в 2D или 3D или xenografts, тем самым расширяя горизонт различных экспериментальных моделей, которые могут быть применены для изучения профилей PTMs.