ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

ここで提案される方法は、特定の状態(治療、分化など)に関連する潜在的な変化を同定するために、培養哺乳動物細胞からユビキチンファミリーメンバーによって媒介されるPTMを研究することに専念している。PTMはタンパク質の機能の調節の最後のステップ^{を表す 1}.実際、一度翻訳機械によって製造されると、ほとんどのタンパク質は、その活性、分子相互作用、および細胞内^位置1を調節する異なる種類のPTMを受けるわけではない。PTMの多くは、タンパク質のユビキチンファミリーによって媒介されるもの、ユビキチン自体およびすべてのユビキチン様、細胞内または部分的に細胞質タンパク^質2を調節する可能性を有する。それらはそれ自体がタンパク質であるため、互いに共役することができ、多様なトポロジの均質および異種鎖を形成し、それぞれが特定の調節機能^{に関連する2。}この複雑な機械を解読し、理解するためには、ツールが必要です。多くのアプローチは、独自の長所と短所を持って、世界中で開発され、ここでは培養細胞に適した高性能なものを提案します。

この方法の主な利点は、その精度です。実際、単離された修飾タンパク質の純度は、2つのタグ(6HisとFlag)と2つのステップ手順の組み合わせ使用によって高度に改善され、したがって、単一のタグ融合Ub/Ubl^3、4よりもはるかに選択的である。6Hisタグの存在は、完全変性状態での精製の第一段階を可能にし、それによってユビキチン結合ドメインまたはユビキチン化されたものに結合する他のタンパク質を含むタンパク質の共精製を回避する。これは、特異的^抗体5またはタンデムユビキチン結合要素(TUBEs)6のいずれかを用いたユビキチン化プロテオームの親和性精製に基づく他のいくつかのアプローチによって遭遇する技術的問題である。重要なことに、この技術は、モノおよび異なる種類の多言語の両方^が7を同定したので、いくつかの他のアプローチの場合と同様に、特定のタイプのユビキチン化の精製を支持するバイアスではない。したがって、いったん発見されると、ユビキチン化の変化は、関連するユビキチン化の正確な種類を特定するために、標準的な生化学的アプローチによってより詳細に検討されなければなりません。

最後に、このプロトコルのもう一つの技術的な利点は、レンチウイルスの使用であり、それは容易かつ迅速に、正常な細胞挙動を妨げることなく、タグ付き修飾剤の妥当なレベルの発現を有する安定した発現細胞株を作成する。

ユビキチン化の重要な役割の1つはプロテアソーム分解のためのタンパク質を標的とすることであるのに対し、潜在的に最も細胞内または部分的に細胞内タンパク^質1に対する他の多くの調節特性を有することが知られている。これらの機能の数は、タンパク質のような多くのユビキチンの存在によってさらに増強され、ほぼすべての細胞機構を調節するタンパク質のファミリー^{を形成する1.}彼らの改変は、細胞生物学に大きな影響を与える可能性があり、^癌9のような病理学的^状況8を導いたり、参加したりすることができる。したがって、ツールは、この広大な風景を探索し、新しい治療目標として役立つことができる病理学的状態に関連する変化を識別するために必要とされます。

このプロトコルは、励起タグ付き Ub/Ubl を発現するために伝達する必要があるため、培養中の細胞専用です。これらの安定した細胞株を作成すると、2Dまたは3Dまたは異種移植片の培養物からUblプロファイルを生成し、PTMプロファイルの研究に適用できるさまざまな実験モデルの地平線を拡張することができます。