יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

השיטה המוצעת כאן מוקדש לחקר הגברת המתווכת על ידי בני משפחה אוביקוויב מתאי יונקים מתורבתים כדי לזהות שינויים פוטנציאליים הקשורים בתנאי ספציפי (טיפול, בידול, וכו ‘). פטין מייצג את השלב האחרון של רגולציה של החלבונים ‘ פונקציות¹. אכן, לאחר שיוצרו על ידי מכונות הטרנסלטיות, רוב אם לא כל החלבונים עוברים סוגים שונים של פטין כי לווסת את פעילותם, אינטראקציות מולקולריות, ו תאיים מיקום¹. בין שפע של לפטין הם אלה בתיווך על ידי משפחת אוביקוויב של חלבונים, אוביקוויב עצמו ואת כל אוביקוויב-אוהב, יש את הפוטנציאל לווסת את כל החלבונים תאיים או חלקי cytoplasmic². בגלל שהם עצמם חלבונים, הם יכולים להיות מצויידים אחד לשני, יצירת רשתות הומוגנית והטרוגנית של טופולוגיות שונות, כל אחד משויך פונקציות רגולטוריות ספציפיות². כלים נחוצים כדי לנסות לפענח ולהבין זה מכונות מורכבות. גישות רבות פותחו ברחבי העולם, בעלי יתרונות וחסרונות משלהם, וכאן אנו מציעים אחד עם ביצועים גבוהים המתאימים לתאים מתורבתים.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הדיוק שלה. אכן, הטוהר של חלבונים מבודדים שונה הוא משופר מאוד על ידי שימוש קומבינטורית של שני התגים (6his ודגל) ואת שני הליך ההליך ולכן זה הרבה יותר סלקטיבי מאשר תג אחד פיוז ‘ ן ו/ubl^3,4. הנוכחות של התגית 6His מאפשר צעד ראשון של טיהור במצב מלאה לחלוטין ובכך הימנעות כל שיתוף טיהור של חלבונים המכילים אוביקוויב כריכה האיגוד או מחייב חלבונים אחרים של הכריכה. זוהי בעיה טכנית נתקל מספר גישות אחרות המבוססות על טיהור אהדה של פרוטמס אובימבחנות באמצעות נוגדנים ספציפיים⁵ או מרכיבים כריכה אוביקוויב (צינוריות)⁶. חשוב מכך, טכניקה זו אינה מוטה לטובת טיהור של סוג מסוים של אוביקווינציה, כפי שהוא יכול להיות במקרה של גישות אחרות, שכן הן מונו והן סוגים שונים של polyubiquitinations זוהו⁷. כתוצאה מכך, לאחר שנמצא, שינוי של אוביקווינציה יהיה צריך ללמוד בפרטים נוספים על ידי גישות ביוכימיות סטנדרטיות כדי לזהות את הסוג המדויק של אוביקווינציה המעורבים.

לבסוף, יתרון טכני נוסף של פרוטוקול זה הוא השימוש של וירוסים, כי בקלות ובמהירות יוצר ביטוי יציב קווי התא עם רמה סבירה של ביטויים של משנה מתויג מבלי להפריע התנהגות סלולרית נורמלית.

ואילו תפקיד חשוב אחד של אוביקווינציה היא למקד חלבונים עבור השפלה פרוטאספאל, ידוע כיום כי יש לו תכונות רגולטוריות רבות אחרות עבור חלבונים ביותר תאיים או באופן חלקי תאיים¹. מספר הפונקציות הללו מוגבר עוד יותר על-ידי קיומם של אוביקווינים רבים כמו חלבונים, ויוצרים משפחה של חלבונים המסדירים כמעט כל מנגנוני תא¹. שינויים שלהם יכול להיות השפעה דרסטית על ביולוגיה התא יכול להוביל או להשתתף במצבים פתולוגיים⁸, כגון סרטן⁹. מכאן, כלים נחוצים כדי לחקור את הנוף העצום הזה ולזהות את השינויים הקשורים במצב פתולוגי שיכול לשמש כמטרות טיפוליות מספר.

פרוטוקול זה מוקדש תאים בתרבות מאז הם צריכים להיות מתותמרים כדי לבטא אקסוגני מתויג ועוד/Ubl. לאחר שנוצר, אלה קווי תא יציבה ניתן להשתמש כדי ליצור פרופילים Ubl מהתרבות ב 2D או 3D או שתלי xenografts ובכך להאריך את האופק של מודלים ניסיוניים שונים, כי ניתן להחיל על לימוד לימודי פרופילים.