Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

De hier voorgestelde methode is gewijd aan het bestuderen van Ptm’s gemedieerd door de ubiquitine familieleden uit gekweekte zoogdiercellen om mogelijke veranderingen in verband met een specifieke aandoening te identificeren (behandeling, differentiatie, enz.). Ptm’s vertegenwoordigen de laatste stap in de regulering van de functies van eiwitten¹. Inderdaad, eenmaal geproduceerd door de translationele machines, de meeste zo niet alle eiwitten ondergaan verschillende soorten Ptm’s die hun activiteit moduleren, moleculaire interacties, en intracellulaire locatie¹. Onder de overvloed aan Ptm’s zijn degenen die worden bemiddeld door de ubiquitine familie van eiwitten, ubiquitine zelf en alle ubiquitine-likes, hebben het potentieel om alle intracellulaire of gedeeltelijk cytoplasmische eiwitten reguleren². Omdat ze zelf eiwitten zijn, kunnen ze aan elkaar worden geconjugeerd, en vormen homogene en heterogene ketens van verschillende topologieën, elk geassocieerd met specifieke regelgevende functies². Tools zijn nodig om te proberen om deze complexe machines te ontcijferen en te begrijpen. Veel benaderingen werden wereldwijd ontwikkeld, met hun eigen voor-en nadelen, en hier stellen we een met hoge prestaties geschikt voor gekweekte cellen.

Het belangrijkste voordeel van deze methode is de nauwkeurigheid. Inderdaad, de zuiverheid van geïsoleerde gemodificeerde eiwitten wordt sterk verbeterd door het combinatorische gebruik van de twee tags (6his en vlag) en de twee stap-procedure en daarom is het veel selectiever dan een enkele tag Fusion UB/UBL^3,4. De aanwezigheid van de 6His-tag maakt een eerste stap van zuivering mogelijk in een volledig denaturerende aandoening, waardoor elke co-zuivering van eiwitten die ubiquitine-bindende domeinen of andere eiwitten bevatten die aan de alomtegenwoordige stoffen binden, wordt vermeden. Dit is een technisch probleem dat wordt ondervonden door verschillende andere benaderingen op basis van affiniteits zuivering van alomtegenwoordige proteomes met behulp van specifieke antilichamen⁵ of tandem ubiquitine bindings elementen (buizen)⁶. Belangrijk is dat deze techniek niet bevooroordeeld is ten gunste van de zuivering van een bepaald type Ubiquitination, omdat het voor sommige andere benaderingen het geval zou kunnen zijn, omdat zowel mono als verschillende soorten polyubiquitinaties werden geïdentificeerd⁷. Als gevolg hiervan zal een wijziging van ubiquitatie in meer details moeten worden bestudeerd door standaard biochemische benaderingen om de exacte soort alomtegenwoordige activiteiten te identificeren.

Tot slot, een ander technisch voordeel van dit protocol is het gebruik van lentivirussen, dat gemakkelijk en snel creëert stabiele uitdrukken cellijnen met redelijke niveau van expressies van Tagged modifier zonder interfereren met de normale cellulaire gedrag.

Overwegende dat een belangrijke rol van ubiquitisatie is om eiwitten te richten op proteasomale afbraak, het is nu bekend dat het vele andere regulatoire eigenschappen heeft voor potentieel meest intracellulaire of gedeeltelijk intracellulaire eiwitten¹. Het aantal van deze functies wordt verder versterkt door het bestaan van veel ubiquitine zoals eiwitten, het vormen van een familie van eiwitten die bijna elke cel mechanismen reguleren¹. Hun wijzigingen kunnen drastische gevolgen hebben voor de celbiologie en kunnen leiden of deelnemen aan pathologische situaties⁸, zoals kanker⁹. Daarom zijn gereedschappen nodig om dit uitgestrekte landschap te verkennen en de veranderingen te identificeren die gepaard gaan met een pathologische aandoening die als nieuwe therapeutische doelen kan dienen.

Dit protocol is gewijd aan cellen in de cultuur, omdat ze moeten worden getransduceerde om exogene Tagged UB/UBL uit te drukken. Eenmaal gemaakt, kunnen deze stabiele cellijnen worden gebruikt om UBL-profielen te genereren van cultuur in 2D of 3D of xenografts, waardoor de horizon van de verschillende experimentele modellen die kunnen worden toegepast om PTMs-profielen te bestuderen, wordt verlengd.