تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه
Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء اوبيكييتين (Ub) و اوبيكويتين-أمثال (Ubls) بروتينيه محدده من أجل تحديد التعديلات من هذا النوع من التعديلات بعد الانتقالية (PTMs) ، المرتبطة بحاله معينه مثل العلاج أو النمط الظاهري.
Abstract
اوبيكويتين (ub) و اوبيكويتين (ubl) تعتمد التعديلات بعد الانتقالية من البروتينات تلعب الأدوار التنظيمية البيولوجية الاساسيه داخل الخلية عن طريق التحكم في استقرار البروتين ، والنشاط ، والتفاعلات ، وتوطين الخلايا. فهي تمكن الخلية من الاستجابة للإشارات والتكيف مع التغيرات في بيئتها. التعديلات داخل هذه أليات يمكن ان يؤدي إلى حالات مرضيه شديده مثل امراض الأعصاب والسرطان. والهدف من هذه التقنية الموصوفة هنا هو إنشاء ملفات PTMs التابعة ل ub/ubls ، بسرعة ودقه ، من خطوط الخلايا المستزرعة. وتسمح المقارنة بين الملامح المختلفة التي يتم الحصول عليها من ظروف مختلفه بتحديد التعديلات المحددة ، مثل تلك التي يسببها العلاج علي سبيل المثال. يتم تنفيذ لينتيفيرال الخلية بوساطة لإنشاء خطوط خلايا مستقره التعبير عن اثنين من العلامات (6 له والعلم) الإصدار من المعدل (اوبيكويتين أو ubl مثل SUMO1 أو Nedd8). هذه العلامات تسمح لتنقيه اوبيكويتين التالي من البروتينات اوبيتاميناتيد من الخلايا. ويتم ذلك من خلال عمليه تنقيه من خطوتين: يتم تنفيذ أول واحد في ظروف التعتيم باستخدام علامة 6 له ، والثانية في الظروف الاصليه باستخدام علامة العلم. وهذا يؤدي إلى عزله شديده التحديد ونقيه من البروتينات المعدلة التي يتم تحديدها فيما بعد ونصف الكمية بواسطة اللوني السائل متبوعا بتكنولوجيا الطيف الكتلي (LC-MS/MS) الترادفية. يتيح التحليل المعلوماتي السهل لبيانات MS باستخدام برنامج Excel إنشاء ملفات تعريف PTM عن طريق القضاء علي إشارات الخلفية. وتقارن هذه التوصيفات بين كل حاله من أجل تحديد التعديلات المحددة التي ستدرس بعد ذلك بشكل أكثر تحديدا ، بدءا من التحقق من صحتها بواسطة تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية.
Introduction
الطريقة المقترحة هنا مكرسه لدراسة PTMs بوساطة افراد الاسره اوبيكويتين من خلايا الثدييات مثقف من أجل تحديد التغييرات المحتملة المرتبطة بحاله معينه (العلاج ، والتمايز ، الخ). PTMs تمثل الخطوة الاخيره من تنظيم وظائف البروتينات1. في الواقع ، مره واحده التي تنتجها آلات الانتقالية ، ومعظم ان لم يكن جميع البروتينات الخضوع لأنواع مختلفه من PTMs التي تعدل نشاطها ، والتفاعلات الجزيئية ، والموقع داخل الخلايا1. من بين عدد كبير من PTMs هي تلك التي توسط من قبل عائله اوبيكييتين من البروتينات ، اوبيكويتين نفسها وجميع الأمثال اوبيكويتين ، لديها القدرة علي تنظيم جميع البروتينات الخلوية أو جزئيا الخلايا الدهنية2. لأنها هي نفسها البروتينات ، ويمكن ان تكون مترافقة مع بعضها البعض ، وتشكيل سلاسل متجانسة وغير متجانسة من طبولوجيا متنوعة ، كل المرتبطة بوظائف تنظيميه محدده2. هناك حاجه إلى أدوات لمحاولة فك وفهم هذه آلات المعقدة. تم تطوير العديد من النهج في جميع انحاء العالم ، وجود مزاياها وعيوبها الخاصة ، وهنا نقترح واحده مع أداء عاليه مناسبه للخلايا مثقف.
الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي دقتها. في الواقع ، يتم تحسين نقاء البروتينات المعدلة المعزولة بشكل كبير من خلال استخدام التوافقية اثنين من العلامات (6 له والعلم) والاجراء خطوتين ، التالي فانه هو أكثر انتقائية بكثير من الانصهار علامة واحده Ub/ubl3،4. ان وجود العلامة السادسة يتيح الخطوة الاولي لتنقيه الحالة بشكل كامل التالي تجنب اي تنقيه مشتركه للبروتينات التي تحتوي علي النطاقات الملزمة بالبالكامل أو البروتينات الأخرى الملزمة لتلك البروتينات. هذه هي مشكله تقنيه واجهتها العديد من النهج الأخرى علي أساس التقارب تنقيه البروتينات اوبيتامينيد باستخدام اما الأجسام المضادة المحددة5 أو جنبا بالترادف العناصر الملزمة (أنابيب)6. الأهم من ذلك ، فان هذه التقنية ليست متحيزة لصالح تنقيه نوع معين من العرافة ، كما انه يمكن ان يكون الحال بالنسبة لبعض النهج الأخرى ، لأنه تم تحديد كل من أحاديه وأنواع مختلفه من polyubiquitinations7. التالي ، وبمجرد العثور عليها ، سيكون من الممكن دراسة تغيير في الكل بمزيد من التفاصيل عن طريق النهج الكيميائية الحيوية القياسية من أجل التعرف علي النوع الدقيق من الرغبة المطلقة المعنية.
وأخيرا ، ميزه تقنيه أخرى من هذا البروتوكول هو استخدام لينتيفيروسيس ، التي بسهوله وسرعه يخلق مستقره خطوط الخلايا التعبير مع مستوي معقول من التعبيرات معدل الموسومة دون التدخل في السلوك الخلوي العادي.
في حين ان أحد الأدوار الهامه للإبداء هو استهداف البروتينات للتحلل البروتيني ، فمن المعروف الآن ان لديها العديد من الخصائص التنظيمية الأخرى للبروتينات المحتملة داخل الخلايا أو جزئيا1. زادت الرقم من هذا اعمال أكثر بالوجود من كثير [اوبيقوتين] مثل بروتينات, يشكل أسره البروتينات ينظم تقريبا كل خليه اليه1. تعديلاتها يمكن ان يكون لها تاثير جذري علي بيولوجيا الخلية ، ويمكن ان يؤدي أو المشاركة في الحالات المرضية8، مثل السرطان9. التالي ، هناك حاجه إلى أدوات لاستكشاف هذه المناظر الطبيعية الشاسعة وتحديد التعديلات المرتبطة بحاله مرضيه يمكن ان تكون بمثابه أهداف علاجيه جديده.
ويكرس هذا البروتوكول للخلايا في الثقافة لأنها تحتاج إلى ان تكون محوله للتعبير عن الخارجية الموسومة Ub/Ubl. وبمجرد إنشائها ، يمكن استخدام هذه الخطوط الخلوية المستقرة لتوليد ملفات Ubl من الثقافة في 2D أو 3D أو xenografts ، التالي توسيع أفق النماذج التجريبية المختلفة التي يمكن تطبيقها لدراسة لمحات PTMs.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وضعنا منهجيه قويه وموثوق بها لتوليد لمحات من البروتينات التي تم تعديلها من قبل أعضاء الاسره الرئيسية اوبيكويتين. في الواقع ، لقد نجحنا في تطبيق هذا البروتوكول لتوليد لمحات من PTMs من قبل اوبيكويتين ، وأيضا من قبل السومو و Nedd8 ، وللكشف عن التعديلات المرتبطة بالعلاج7، استجابه …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما من قبل La رابطه المكافحة السرطان إلى الجهد الحاد والماجستير ، والرابطة من أجل البحوث والسرطان إلى PS ، الانكا (معهد السرطان الوطنية) و Canceropole باكا إلى التنفيذ المشترك. مرفق الطيف الكتلي من البروتينات مرسيليا (marseille-proteomique.univ-amu.fr) بدعم من IBISA (البنية التحتية بيولوج Santé et Agronomie) ، الهضبة التكنولوجية ايكس مرسيليا ، والمركز الكبير ، بروفانس-ألب-كوت دازور ريجيون ، ومعهد باولي-كالميتيتس ، ومركز البحوث الخاصة بمرسيليا.
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
References
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature’s escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).
- Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin. Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Matsumoto, M., et al. Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome. Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).
- Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins. Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).
- Bonacci, T., et al. Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).
- Hoeller, D., Dikic, I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy. Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).
- Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
