Un método autodirigido estático para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas
Summary
Este protocolo se generó como un medio para producir organoides cerebrales de una manera simplificada y de bajo costo sin factores de crecimiento exógenos o matriz de membrana de sótano sin dejar de mantener la diversidad de tipos de células cerebrales y muchas características de la organización celular.
Abstract
Los organoides cerebrales humanos diferenciados de las células madre embrionarias ofrecen la oportunidad única de estudiar interacciones complicadas de múltiples tipos de células en un sistema tridimensional. Aquí presentamos un método relativamente sencillo y barato que produce organoides cerebrales. En este protocolo las células madre pluripotentes humanas se dividen en pequeños racimos en lugar de células individuales y se cultivan en medios básicos sin una matriz de membrana de sótano hetróloga o factores de crecimiento exógenos, lo que permite que las señales intrínsecas de desarrollo crecimiento del organoide. Este sistema simple produce una diversidad de tipos de células cerebrales incluyendo células gliales y microgliales, células madre y neuronas del cerebro forebrain, cerebro medio y cerebro trasero. Los organoides generados a partir de este protocolo también muestran señas de identidad de una organización temporal y espacial adecuada demostrada por imágenes de campo brillante, histología, inmunofluorescencia y reacción en cadena cuantitativa de transcripción inversa en tiempo real ( qRT-PCR). Debido a que estos organoides contienen tipos celulares de varias partes del cerebro, se pueden utilizar para estudiar una multitud de enfermedades. Por ejemplo, en un artículo reciente demostramos el uso de organoides generados a partir de este protocolo para estudiar los efectos de la hipoxia en el cerebro humano. Este enfoque se puede utilizar para investigar una serie de condiciones difíciles de estudiar, como discapacidades del neurodesarrollo, trastornos genéticos y enfermedades neurológicas.
Introduction
Debido a innumerables limitaciones prácticas y éticas, ha habido una gran dificultad en el estudio del cerebro humano. Mientras que los estudios que utilizan roedores han sido críticos para nuestra comprensión del cerebro humano, el cerebro del ratón tiene muchas diferencias1,2. Curiosamente, los ratones tienen una densidad neuronal que es al menos 7 veces menor que el cerebro de primate3,4. Aunque los primates están más cerca de los seres humanos que los roedores desde un punto de vista evolutivo, no es práctico para la mayoría de los investigadores trabajar con ellos. El propósito de este protocolo era recapitular muchas características importantes del cerebro humano usando un método simplificado y menos costoso sin la necesidad de una matriz de membrana de sótano hetróloga o factores de crecimiento exógenos mientras se mantiene la diversidad de células cerebrales y la organización celular.
El trabajo formativo del laboratorio Sasai utilizó el método de cultivo libre de suero de cuerpos embrionarios (SFEBq) para generar tipos de células neuronales bidimensionales y tridimensionales a partir de células madre embrionarias señaladas (ESC)5,6. Muchos métodos organoides del cerebro humano han seguido un camino relativamente similar de esCs 8señalizado. Por el contrario, este protocolo comienza con grupos de ESC sinfunciones humanas (HESC), similares a los pasos iniciales del trabajo seminal de los laboratorios Thomson y Zhang antes de los pasos9,10, así como el paso inicial del protocolo organoide cerebral del laboratorio Pasca antes de la adición de factores de crecimiento exógenos11. Las matrices de membranas de sótano (por ejemplo, matrigel) se han utilizado en muchos protocolos de organoides cerebrales y se ha demostrado que es un andamio eficaz8. Sin embargo, las matrices de membrana de sótano más utilizadas no vienen sin complicaciones, ya que co-purifican con cantidades desconocidas de factores de crecimiento con la variabilidad lote a lote durante la producción12. Además, estas matrices pueden complicar la toma de imágenes y aumentar el riesgo de contaminación y costo.
Mientras que los organoides del cerebro humano se pueden utilizar para responder a muchas preguntas, hay ciertas limitaciones a tener en cuenta. Por un lado, a partir de las células madre embrionarias, los organoides se asemejan más a los cerebros inmaduros que los cerebros envejecidos y, como tal, pueden no ser modelos ideales para enfermedades que ocurren en la vejez, como la enfermedad de Alzheimer. En segundo lugar, mientras que nuestro protocolo encontró marcadores de desarrollo de cerebro súbdito, cerebro medio y cerebro trasero que son útiles para estudiar el efecto de un tratamiento o enfermedad en las células de múltiples regiones cerebrales en concierto, otros protocolos se pueden seguir para concentrarse en regiones cerebrales específicas13,14. Finalmente, otra limitación de los modelos organoides es la del tamaño, mientras que la longitud media de un cerebro humano de aproximadamente 167 mm, organoides cerebrales hechos con el uso de agitación crecen hasta 4 mm8 y los organoides formados por este protocolo crecen a 1-2 mm por 10 semanas. Sin embargo, este protocolo proporciona una herramienta importante para estudiar el tejido cerebral humano y la interacción de múltiples tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al igual que otros modelos de organoides, este es un sistema artificial que viene con varias advertencias. Aunque había poca variación de lote a lote en términos de niveles generales de expresión, los organoides individuales mostraban diferencias. Por ejemplo, la ubicación de las áreas positivas de Sox-2 no era idéntica en todos los organoides(Figura 3). Mientras que qPCR es adecuado para buscar cambios generales en lotes de células, técnicas adicionales como RNAseq de una sola célula se utiliz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Núcleo de Células Madre de Yale (YSCC, por sus principales servicios) por su ayuda. Agradecemos al Dr. Jung Kim por su revisión de neuropatología. Este trabajo fue apoyado por Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes y NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), el Yale Cancer Center y el Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) y un generoso regalo sin restricciones de Joseph y Lucille Madri.
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. . The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
